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    pSS大鼠肺功能變化與Notch通路及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的關(guān)系①

    2019-10-23 00:40:50
    中國(guó)免疫學(xué)雜志 2019年18期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞因子通路炎癥

    王 坤 萬 磊 劉 健

    (安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,合肥230031)

    原發(fā)性干燥綜合征(primary Sjogren′s synd-rome,pSS)是成人常見的自身免疫性疾病,其特征在于腺體分泌異常,可以以不同的方式影響肺部。肺間質(zhì)病變與pSS關(guān)系密切[1,2],間質(zhì)性肺病通常是pSS的肺部表現(xiàn)[3,4]。pSS的肺部受累導(dǎo)致肺間質(zhì)病變和肺實(shí)質(zhì)的破壞,最終導(dǎo)致肺功能降低[5]。輔助T細(xì)胞(Th)參與pSS肺功能損傷過程。Th1細(xì)胞主要分泌IL-2等,參與細(xì)胞炎癥反應(yīng);Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5等,參與體液免疫應(yīng)答。Th17細(xì)胞分泌效應(yīng)因子IL-17,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),IL-17可通過促進(jìn)釋放前炎性細(xì)胞因子來放大炎癥反應(yīng)。Notch信號(hào)通路在肺間質(zhì)病變中發(fā)揮作用[6]。Notch信號(hào)通路是一種高度保守的通路,對(duì)正常胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、特化和分化至關(guān)重要,并與肺間質(zhì)纖維化疾病有關(guān)[7]。Notch通路通過跨膜配體激活受體參與T細(xì)胞活化[8]。 Notch通路抑制劑可通過調(diào)節(jié)Th1和Th2細(xì)胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)而減少肺部炎癥[9]。 Notch信號(hào)通路異常激活可致使成纖維細(xì)胞異常增殖,并分化為肌成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)[10],最終出現(xiàn)肺部病變導(dǎo)致肺功能降低。從Notch信號(hào)通路調(diào)節(jié)Treg角度觀察pSS肺功能變化,為進(jìn)一步探討其可能的機(jī)制本研究設(shè)計(jì)如下方案。

    1 材料與方法

    1.1材料 清潔級(jí)SD大鼠16只,體重(150±20)g,5~6月齡,購自安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。IL-2、IL-5、IL-17、免疫球蛋白κJ區(qū)域(RBP-J)試劑購自上海源葉生物公司。流式細(xì)胞術(shù)試劑購自美國(guó)eBioscience公司。PCR試劑購自美國(guó)Invitrogen公司。免疫印跡相關(guān)試劑購自美國(guó)Abcam公司。頜下腺蛋白購自上海生扶生物。弗氏完全佐劑購自美國(guó)Sigma公司。

    1.2方法

    1.2.1pSS大鼠模型構(gòu)建[11,12]大鼠隨機(jī)分為正常組和模型組。模型組大鼠兩后足足跖部皮下注射頜下腺蛋白與弗氏完全佐劑混合后的乳化物,0.2 ml/鼠。建立pSS模型。

    1.2.2肺功能檢測(cè) 采用動(dòng)物肺功能儀測(cè)定肺功能,包括一秒用力呼氣容積(Forced expiratory volume in 1 second,FEV1)、50%肺活量的最大呼氣流量(50% Forced expiratory flow,FEF50)、FEF75、用力最大呼氣流量(Peak expiratory flow,PEF)。

    1.2.3IL-2、IL-5、IL-7、RBP-J表達(dá) 取大鼠新鮮血液,離心取上清液,檢測(cè)大鼠血清IL-2、IL-5、IL-17、RBP-J表達(dá)。根據(jù)ELISA操作步驟檢測(cè)IL-2、IL-5、IL-17、RBP-J OD值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)算IL-2、IL-5、IL-17、RBP-J濃度。

    1.2.4外周血Treg檢測(cè) 取大鼠新鮮血液100 μl,按106個(gè)細(xì)胞/管分別加入抗鼠CD4-FITC(0.25 μg)+抗鼠CD25-PE (0.25 μg)+抗鼠Notch1-APC(1.0 μg),抗鼠CD4-FITC(0.25 μg)+抗鼠CD25-PE (0.25 μg)+抗Notch3-APC(1.0 μg),陰性對(duì)照管加入相應(yīng)同型對(duì)照抗體。依次進(jìn)行固定、通透細(xì)胞,避光20~30 min;加紅細(xì)胞裂解液1 ml,避光15~25 min;離心棄上清,重懸于500 μl PBS液中,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

    1.2.5Notch通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá) 基因檢測(cè):根據(jù)GenBank 設(shè)計(jì)引物并合成。引物序列如下:Notch1上游5′-TCGTCTCCGACTTCGTCTATCA-3′,下游5′-TGCAGAGCAGACTTGCCTA-3′;Notch2上游5′-ATGGGCTCTAAGGTATTTCTGG-3′,下游5′-CAGAGCTCGCTTGTCGTG-3′;Notch3上游5′-CTCTGGTTTCCAGAGGGTTT-3′,下游5′-CCAGTTCGGTCAGTTCGTG-3′;Notch4上游5′-GGACTGGGAAAT-CCCGAACC-3′,下游5′-GGCATCTTTATCCGCTCCA-3′;Jagged1上游5′-GCATCGGCTCAGGGTCTG-3′,下游5′-AGTCGCCTGGGAGTTTGC-3′;Jagged2上游5′-GGGCTCTTGCCACGAAGT-3′,下游5′-AGGCACG-GTATCCCTTCG-3′;Delta1上游5′-CCTGGCGACCAC GCAACA-3′,下游5′-CAGCACCCTCCATTCCTG-3′;GAPDH上游5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′,下游5′-CCACAGTCCATGCCATCACT-3′。參照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行大鼠肺組織RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)。蛋白檢測(cè):參考說明書進(jìn)行肺組織蛋白提取、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、蛋白檢測(cè)。數(shù)據(jù)分析處理:用掃描儀對(duì)膠片進(jìn)行掃描、攝像;采用Quantity one 灰度分析軟件進(jìn)行分析。計(jì)算各組條帶的灰度值,以目的蛋白與各組內(nèi)參β-actin灰度值的比值做為蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

    2 結(jié)果

    2.1肺功能變化 與正常組比較,模型組大鼠FEV1等各項(xiàng)肺功能參數(shù)均有明顯降低(P<0.05)。見圖1。

    圖1 兩組肺功能參數(shù)比較 Fig.1 Comparison of lung function parameters of twogroupsNote: Compared with normal group,*.P<0.05.

    圖2 兩組血清細(xì)胞因子IL-2、IL-5、IL-17和RBP-J水平比較Fig.2 Comparison of serum cytokines IL-2,IL-5,IL-17 and RBP-J level in two groupsNote: Compared with normal group,*.P<0.05,**.P<0.01.

    GroupsCD4+CD25+TregCD4+CD25+Notch1+TCD4+CD25+ Notch3+TNormal14.67±5.9879.97±19.0983.31±19.69Model 7.07±3.361)63.25±19.371)70.58±20.381)

    Note:Compared with normal group,1)P<0.01.

    GroupsNotch1Notch2Notch3Notch4Delta1Jagged1Jagged2Normal0.87±0.250.90±0.390.51±0.200.85±0.250.54±0.90.49±0.190.48±0.19Model 0.94±0.360.93±0.410.97±0.252)0.87±0.210.90±0.132)0.93±0.182)0.74±0.201)

    Note:Compared with normal group,1)P<0.05,2)P<0.01.

    圖3 肺組織 Notch 通路相關(guān)蛋白表達(dá)量Fig.3 Expression of Notch pathway related proteins in lung tissueNote: 1.Normal group;2.Model group.

    2.2血清細(xì)胞因子 IL-2、IL-5、IL-17和RBP-J水平的變化 與正常組比較,模型組細(xì)胞因子IL-2、IL-17顯著升高,細(xì)胞因子IL-5及RBP-J降低(P<0.05或P<0.01)。見圖2。

    2.3外周血CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+Notch1+T和CD4+CD25+Notch3+T細(xì)胞變化 與正常組比較,模型組大鼠外周血CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+Notch1+T和CD4+CD25+Notch3+T細(xì)胞表達(dá)均降低(P<0.01)。見表1。

    2.4肺組織Notch相關(guān)基因表達(dá)變化 與正常組相比,模型組Notch通路相關(guān)蛋白Notch3、Delta1、Jagged1、Jagged2表達(dá)升高(P<0.05或P<0.01)。見表2、圖3。

    3 討論

    T淋巴細(xì)胞在免疫疾病發(fā)病機(jī)制中具有重要作用,它涉及激活活化的CD4+T細(xì)胞以引發(fā)特異性效應(yīng)細(xì)胞因子的分泌[13,14]。初始CD4+T細(xì)胞可以根據(jù)極化細(xì)胞因子信號(hào)分化成Th1、Th2和Treg。Th細(xì)胞參與炎性疾病的發(fā)生。CD4+T細(xì)胞分泌的炎癥細(xì)胞因子浸潤(rùn)到氣道,黏液分泌過多,嗜酸性粒細(xì)胞聚集,導(dǎo)致免疫炎癥反應(yīng)和肺部炎癥聚集。大量集聚的炎癥反應(yīng)進(jìn)一步致使肺功能參數(shù)FEV1、FEF、PEF降低。

    Th1/Th2細(xì)胞因子穩(wěn)定性是pSS肺損傷的重要指標(biāo)。Th細(xì)胞在氣道炎癥中起作用。Th1細(xì)胞主要產(chǎn)生IL-2等。Th2細(xì)胞因子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞因子IL-5分泌而控制免疫反應(yīng),釋放炎癥介質(zhì)。引起炎癥反應(yīng)升高而損傷肺組織。Th17細(xì)胞釋放IL-17可誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和巨噬細(xì)胞募集,IL-17參與中性粒細(xì)胞積聚和中性粒細(xì)胞激活,細(xì)胞因子IL-17增加表明細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥增加。本研究發(fā)現(xiàn)pSS大鼠細(xì)胞因子IL-2、IL-17顯著升高,細(xì)胞因子IL-5及RBP-J降低。Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑包括進(jìn)化保守的細(xì)胞間通信系統(tǒng),其在胚胎發(fā)育和成體期間控制細(xì)胞增殖、分化。 Notch信號(hào)通路在T細(xì)胞系發(fā)育的多個(gè)步驟中起著至關(guān)重要的作用,對(duì)于Th細(xì)胞分化十分關(guān)鍵。Notch通路也在調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞分化中發(fā)揮作用[15]。Notch信號(hào)參與T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。研究表明,Notch信號(hào)傳導(dǎo)可促進(jìn)Th2反應(yīng),Notch配體調(diào)節(jié)可以促進(jìn)或抑制Th1反應(yīng)[16],Notch信號(hào)途徑調(diào)節(jié)T細(xì)胞向Th1方向分化[17]。研究發(fā)現(xiàn)在肺組織中特別是在CD4+T細(xì)胞中,Notch1 表達(dá)降低[18],可上調(diào)肺組織中Th1/Th2比率。pSS炎癥可由Th2細(xì)胞因子IL-5介導(dǎo)。通過Notch 信號(hào)途徑可調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞分泌IL-5,抑制炎癥反應(yīng)而保護(hù)肺組織。

    Notch通路可通過調(diào)控Treg表達(dá)而參與調(diào)節(jié)Treg功能。Notch 通路主要可調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的分化而介導(dǎo)免疫抑制作用。Notch1與其配體Jagged1結(jié)合后可誘導(dǎo)Treg分化,從而調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的數(shù)量。將CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)染至Notch1受體胞內(nèi)后,體內(nèi)細(xì)胞因子平衡出現(xiàn)變化,如IL-1等促炎癥細(xì)胞因子表達(dá)升高。而采用抑制劑抑制Notch信號(hào)后,可顯著促進(jìn)Treg分泌抑炎細(xì)胞因子IL-10,抑制促炎細(xì)胞因子IL-1β表達(dá)。Notch信號(hào)通路可以通過降低Treg細(xì)胞數(shù)量來介導(dǎo)免疫應(yīng)答,加劇免疫炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)與正常組比較,模型組外周血CD4+CD25+Treg表達(dá)降低,外周血CD4+CD25+Notch1+T細(xì)胞和CD4+CD25+Notch3+T細(xì)胞表達(dá)降低,而細(xì)胞因子IL-2、IL-17顯著升高。說明 Treg免疫耐受能力降低可能直接導(dǎo)致免疫炎癥產(chǎn)生。CD4+CD25+Treg細(xì)胞不但對(duì)pSS大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)有抑制作用,同時(shí)可抑制由炎癥引起的肺組織細(xì)胞損傷。

    綜上所述,Notch信號(hào)通路可以通過降低Treg細(xì)胞數(shù)量,上調(diào)炎性細(xì)胞因子IL-2、IL-17表達(dá),下調(diào)IL-5及RBP-J表達(dá),促使T細(xì)胞向Th1方向分化,導(dǎo)致pSS炎癥反應(yīng)升高,最終導(dǎo)致pSS肺功能降低。

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