miR-3168靶向PDCD5調(diào)控A549細(xì)胞凋亡①

燕國(guó)麗 胡作為 成薇婷

(武漢市第一醫(yī)院腫瘤科，武漢430000)

肺癌仍然是全球癌癥死亡的首要原因[1]，其是導(dǎo)致男性癌癥死亡的主要原因，也是女性癌癥死亡的第二大原因[2]。有研究顯示，相比于正常人群，miR-3168 在肺癌患者中表達(dá)上調(diào)[3]。但是miR-3168表達(dá)上調(diào)的原因和其導(dǎo)致的結(jié)果的分子機(jī)制目前尚無(wú)研究。已經(jīng)在多種人類(lèi)腫瘤中發(fā)現(xiàn)程序性細(xì)胞死亡因子5(Programmed cell death 5,PDCD5)的表達(dá)降低，例如乳腺癌、肝細(xì)胞癌、肺癌、胃癌、慢性髓性白血病、星形細(xì)胞膠質(zhì)瘤、軟骨肉瘤、喉鱗狀細(xì)胞癌和卵巢癌[4]。最近的研究顯示腫瘤抑制因子PDCD5在p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起積極作用[5]，當(dāng)細(xì)胞DNA被破壞時(shí)，PDCD5與Tip60形成復(fù)合物，其從胞質(zhì)溶膠轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，通過(guò)Lys-120處的p53乙?；龠M(jìn)DNA損傷反應(yīng)[6]。此外，PDCD5與BAX相互作用以介導(dǎo)細(xì)胞色素C釋放[4]。另一方面，PDCD5的抑制或敲低都會(huì)減弱癌細(xì)胞的凋亡[7]。盡管PDCD5明顯作為p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的正調(diào)節(jié)因子，但PDCD5在細(xì)胞凋亡過(guò)程中的調(diào)節(jié)方式尚不清楚?；诖?，本研究旨在探討miR-3168通過(guò)調(diào)節(jié)PDCD5對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 pmiR-RB-Report質(zhì)粒購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司(貨號(hào)：GUR100013-P-2)。PDCD5、P21、BAK、P53、BCL-2、TUBULIN抗體購(gòu)自Abcam公司(貨號(hào)：ab83958、ab109520、ab32371、ab32503、ab32124、ab210797)。H3抗體購(gòu)自CST公司(貨號(hào)：4499)。A549細(xì)胞購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司(貨號(hào)：AD0202)。RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自GE health公司(貨號(hào)：SH30091)，胎牛血清購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司(貨號(hào)：10099-133)。蛋白酶抑制劑Cocktail (不含EDTA,mini片劑) 購(gòu)自Bimake公司(貨號(hào)：B14011)。Etoposide(ET)購(gòu)自SELLECK公司(貨號(hào)：S1225)。PBS購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司(貨號(hào)：E607008)。青鏈霉素混合液(×100)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(貨號(hào)：P1400)。ClonExpress Ⅱ One Step Cloning試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司(貨號(hào)：C112-01/02)。2×SDS 蛋白電泳上樣緩沖液購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司(貨號(hào)：WB-0081)。蛋白裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)：P0013)。Xfect RNA Transfection Reagent購(gòu)自TaKaRa公司(貨號(hào)：631318)。Luciferase熒光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒購(gòu)自艾美捷公司(貨號(hào)：K801-200)。miR-3168序列來(lái)自miRBase，miR-3168 mimics和miR-3168 inhibitor購(gòu)自生工基因公司(貨號(hào)：HmiRQP1498,HmiRQP9001)。miRNA快速提取試劑盒購(gòu)自HaiGene公司(貨號(hào)：B1802)。miRNA反轉(zhuǎn)錄和qPCR試劑盒購(gòu)自復(fù)能基因公司(貨號(hào)：QP015)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549維持在含有100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素和10%熱滅活的FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，并在潮濕氣氛(37℃，5%CO2)中培養(yǎng)。 20 ng/ml的ETO處理A549細(xì)胞12 h后收獲細(xì)胞。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 通過(guò)Xfect RNA Transfection Reagent轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞。將WT/MT-3′UTR-PDCD5 的質(zhì)?；騧iR-3168 mimics或miR-3168 inhibitor與轉(zhuǎn)染試劑混合，靜止大約20 min后，緩緩滴入A549細(xì)胞。

1.2.3免疫印跡 用冷的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌A549細(xì)胞并收集。用裂解緩沖液[50 mmol/L Tris-Cl(pH7.5)，150 mmol/L NaCl，1%NP40,10 mmol/L NaF，10 mmol/L焦磷酸鈉和蛋白酶抑制劑]制備細(xì)胞提取物并冰上孵育30 min。用8%SDS-PAGE凝膠分離目的蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。通過(guò)在含有1× PBS和Tween-20(PBST)的5%w/v脫脂牛奶封閉緩沖液中孵育2 h來(lái)封閉膜。將封閉的膜在4℃下與指定的抗體一起溫育過(guò)夜。用1×PBST洗滌后，將膜與適當(dāng)?shù)睦备^(guò)氧化物酶綴合的抗體一起溫育1 h。用ECL試劑顯影。

1.2.4RNA抽取與熒光定量PCR 根據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)，用miRNA快速提取試劑盒和miRNA反轉(zhuǎn)錄和qPCR試劑盒進(jìn)行miRNA分離，DNA以及qPCR反應(yīng)。用每個(gè)基因的正向和反向引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)。將來(lái)自逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的1 μl cDNA加入到含有10 μl 2×SYBR?PremixEx TaqTM和0.2 μmol/L正向和反向引物的20 μl qRT-PCR混合物中。 PCR在ABI 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)中進(jìn)行。將樣品在95℃下孵育10 min，然后再95℃變性10 s，60℃退火延伸30 s，變性退火延伸總計(jì)30個(gè)循環(huán)，之后60℃孵育1 min，將所有樣品標(biāo)準(zhǔn)化為人U6并表達(dá)為倍數(shù)誘導(dǎo)。所有反應(yīng)一式三份進(jìn)行。使用比較方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平和SD。

1.2.5Annexin V染色法 在Annexin V染色之前，將A549細(xì)胞置于37℃，5%CO2和1%O2的缺氧室中16～18 h;將A549細(xì)胞在低氧或含氧量正常的條件下培養(yǎng)2 h，然后在指定的氧條件下用1 μmol/L阿糖胞苷處理16～18 h。之后使用Annexin V染色，使用顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1miR-3168靶向PDCD5的3′UTR 根據(jù)TargetScan生物軟件在線分析，發(fā)現(xiàn)miR-3168與PDCD5的3′UTR有一處高度匹配，處于108～114的位置，見(jiàn)圖1。

將miR-3168與PDCD5的3′UTR匹配區(qū)域做CUCCG的突變，將其與野生型PDCD5的3′UTR克隆進(jìn)pmiR-RB-Report質(zhì)粒中，見(jiàn)圖2。

共轉(zhuǎn)染miR-3168 mimics和WT-PDCD5-3′UTR或MT-PDCD5-3′UTR，利用luciferase report assay檢測(cè)雙熒光素酶活性。相比于對(duì)照組(共轉(zhuǎn)染negative control)，WT-PDCD5-3′UTR組的雙熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而MT-PDCD5-3′UTR無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)圖3?；诖?，miR-3168靶向PDCD5的3′UTR。

圖1 miR-3168與PDCD5的3′UTR高度匹配Fig.1 miR-3168 is highly matched to PDCD5′s 3′UTR

圖2 克隆MT/WT-PDCD5-3′UTRFig.2 Clone MT/WT-PDCD5-3′UTR

圖3 共轉(zhuǎn)染miR-3168與未共轉(zhuǎn)染miR-3168的熒光素酶活性比較Fig.3 Comparison of luciferase activity between co-tran-sfected miR-3168 and unco-transfected miR-3168Note: *.P<0.05.

2.2過(guò)表達(dá)miR-3168時(shí)，PDCD5的表達(dá)量下降，細(xì)胞凋亡水平下降 由于PDCD5介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是為了抵抗DNA損傷[5]，因此用依托泊苷(Etoposi-de,ETO)處理細(xì)胞來(lái)模擬DNA損傷，且用Annexin-V染色來(lái)檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡水平，見(jiàn)圖4。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用ETO處理細(xì)胞后，過(guò)表達(dá)miR-3168時(shí)，相比于對(duì)照組，A549細(xì)胞凋亡水平顯著降低(P<0.05)；而未用ETO處理細(xì)胞時(shí)，無(wú)論是否過(guò)表達(dá)miR-3168，細(xì)胞凋亡水平無(wú)明顯變化(P<0.05)。

圖4 ETO處理后轉(zhuǎn)染miR-3168 mimics與未轉(zhuǎn)染miR-3168 mimics的A549細(xì)胞凋亡水平比較Fig.4 Comparison of apoptosis levels of transfected miR-3168 mimics with A549 cells transfected with miR 3168-mimics after ETO treatmentNote: *.P<0.05.

圖5 過(guò)表達(dá)miR-3168轉(zhuǎn)染miR-3168 mimics與未轉(zhuǎn)染miR-3168 mimics的miR-3168表達(dá)量比較Fig.5 Expression of miR-3168 after transfection of miR-3168 mimicsNote: *.P<0.05.

轉(zhuǎn)染miR-3168 mimics后，用RT-qPCR檢測(cè)miR-3168的表達(dá)量，miR-3168表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖5。ETO處理細(xì)胞12 h后，相比于未轉(zhuǎn)染miR-3168 mimics的Control，PDCD5的表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白P21和BAK的蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，而B(niǎo)CL-2的蛋白表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

因?yàn)镻DCD5通過(guò)P53入核介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡來(lái)抵抗DNA損傷。因此，過(guò)表達(dá)miR-3168后用ETO處理A549細(xì)胞12 h， 抽取細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞核蛋白，發(fā)現(xiàn)ETO未處理時(shí)，P53存在于細(xì)胞質(zhì)中，而ETO處理后，P53進(jìn)入了細(xì)胞核。而過(guò)表達(dá)miR-3168后，P53仍然能入核，但是入核的蛋白量明顯比對(duì)照組低(P<0.05)，見(jiàn)圖7。

圖6 PDCD5與相關(guān)凋亡標(biāo)志蛋白的表達(dá)水平Fig.6 Expression levels of PDCD5 and related apopto-sis marker

圖7 過(guò)表達(dá)miR-3168時(shí)P53的入核情況Fig.7 Nuclear localization of P53 during overexpression of miR-3168

2.3敲低miR-3168時(shí)，PDCD5的表達(dá)量上升，細(xì)胞凋亡水平上升 由于PDCD5介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是為了抵抗DNA損傷[5]，因此用ETO處理細(xì)胞來(lái)模擬DNA損傷，且用Annexin-V染色來(lái)檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡水平，見(jiàn)圖8。發(fā)現(xiàn)用ETO處理細(xì)胞后，敲低miR-3168時(shí)，相比于對(duì)照組，A549細(xì)胞凋亡水平顯著升高P<0.05)；而未用ETO處理細(xì)胞時(shí)，無(wú)論是否敲低miR-3168，細(xì)胞凋亡水平無(wú)明顯變化(P<0.05)。

轉(zhuǎn)染miR-3168 inhibitor后，用RT-qPCR檢測(cè)miR-3168的表達(dá)量，miR-3168表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖9。ETO處理細(xì)胞12 h后，相比于未轉(zhuǎn)染miR-3168 inhibitor的對(duì)照組，PDCD5的表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白P21和BAK的蛋白表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，而B(niǎo)CL-2的蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，見(jiàn)圖10。

圖8 ETO處理后轉(zhuǎn)染miR-3168 inhibitor與未轉(zhuǎn)染miR-3168 inhibitor的miR-3168表達(dá)量比較Fig.8 Comparison of miR-3168 expression in transfected miR-3168 inhibitor and untransfected miR-3168 inhibitor after ETO treatmentNote: *.P<0.05.

圖9 敲低miR-3168后，miR-3168的表達(dá)量Fig.9 Expression of miR-3168 after knockdown of miR-3168Note: *.P<0.05.

圖10 PDCD5與相關(guān)凋亡標(biāo)志蛋白的表達(dá)水平Fig.10 Expression levels of PDCD5 and related apoptosis marker proteins

圖11 敲低miR-3168時(shí)P53的入核情況Fig.11 Nuclearization of P53 at miR-3168 during knockdown

因?yàn)镻DCD5通過(guò)P53入核來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡來(lái)抵抗DNA損傷。因此，敲低miR-3168后用ETO處理A549細(xì)胞12 h，抽取細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞核蛋白，發(fā)現(xiàn)敲低miR-3168后，P53入核的蛋白量明顯比對(duì)照組高(P<0.05)，見(jiàn)圖11。

3 討論

肺癌是中國(guó)癌癥死亡的主要原因[8]，是最危險(xiǎn)的惡性腫瘤之一，其診斷后的5年生存率為15.6%，低于乳腺癌、結(jié)腸癌或前列腺癌的生存率[9]。它可以分為兩種：非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌，分別約占肺癌病例的80%和20%[10]。但是，肺癌的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜[11]，其中細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)異常是肺癌發(fā)生和發(fā)展的一個(gè)重要原因[12]。

相比于正常人群，miR-3168在肺癌患者中呈現(xiàn)一種高表達(dá)的狀態(tài)[3]。但是miR-3168的功能和相關(guān)分子機(jī)制目前尚無(wú)研究。在本研究中，通過(guò)TargetScan分析，發(fā)現(xiàn)miR-3168僅在一個(gè)區(qū)域與PDCD5具有較高匹配度。之后通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，野生型的PDCD5-3′UTR的報(bào)告基因活性在過(guò)表達(dá)miR-3168后明顯降低(P<0.05)，但是突變型的PDCD5-3′UTR報(bào)告基因活性在過(guò)表達(dá)miR-3168后無(wú)明顯變化(P<0.05)。因此，miR-3168靶向結(jié)合PDCD5的3端非編碼區(qū)。并且過(guò)表達(dá)miR-3168時(shí)，PDCD5的表達(dá)量明顯下降(P<0.05)。而轉(zhuǎn)染miR-3168 inhibitor進(jìn)A549細(xì)胞時(shí)，PDCD5的表達(dá)量顯著上升(P<0.05)。

PDCD5被認(rèn)為是促凋亡的分子[13]。Xu等[6]發(fā)現(xiàn)PDCD5可與Tip60相互作用并且抑制Tip60被蛋白酶體降解。在本研究中，過(guò)表達(dá)miR-3168造成PDCD5的表達(dá)量下降后，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白P21和BAK的蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，而B(niǎo)CL-2的蛋白表達(dá)量顯著上升(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染miR-3168 inhibitor進(jìn)A549細(xì)胞時(shí)，PDCD5的蛋白表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白P21和BAK的蛋白表達(dá)量顯著上升(P<0.05)。已發(fā)表的數(shù)據(jù)表明Tip60與p53相互作用并增加p53的穩(wěn)定性和乙?；絒6]。值得注意的是，K120位點(diǎn)上的乙?；莗53依賴(lài)性細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵[14]，此位點(diǎn)乙?；蟮膒53通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控細(xì)胞凋亡。有研究表明泛素E3連接酶DNAJB1使PDCD5不穩(wěn)定以抑制p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[15]。在本研究中，過(guò)表達(dá)miR-3168造成PDCD5的表達(dá)量下降后，P53入核受到抑制(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染miR-3168 inhibitor進(jìn)A549細(xì)胞時(shí)，促進(jìn)P53入核(P<0.05)?；诖?，我們推測(cè)PDCD5是p53的一個(gè)入核促進(jìn)因子，當(dāng)PDCD5缺失時(shí)，p53在K120位點(diǎn)上的乙酰化水平受到影響，p53的入核過(guò)程在抵抗DNA損傷時(shí)受到明顯的抑制。

綜上所述，miR-3168通過(guò)抑制PDCD5表達(dá)量來(lái)抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡。