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    提高液體培養(yǎng)枯草芽孢桿菌芽孢產率的研究

    2019-10-23 01:27:50王昭懿周麗媛
    農產品加工 2019年19期
    關鍵詞:枯草菌體芽孢

    王昭懿,張 鯤,周麗媛,程 嬌,溫 凱,于 梅

    (山東農業(yè)工程學院食品科學與工程學院,山東濟南 250100)

    枯草芽孢桿菌是一種典型的革蘭氏陽性好氧菌,具有很強的酶活性,并且對人畜安全,是一種環(huán)境友好型菌種且能形成芽孢[1]。芽孢作為一種休眠體,能經受高溫、干燥、紫外線、多種化學物質及電離輻射等逆境[2],自由存在的芽孢作為一種隱藏的生命,一旦環(huán)境條件合適,芽孢便可以萌發(fā)成營養(yǎng)細胞。研究表明,枯草芽孢桿菌的芽孢進入動物腸道中,便能迅速萌發(fā)成具有新陳代謝作用的營養(yǎng)型細胞,這種營養(yǎng)型細胞能在動物體內分泌多種消化酶、維生素及氨基酸等物質,進而調節(jié)腸道菌群平衡,改善動物的健康水平和生產性能[3-6]。因此,添加枯草芽孢桿菌制成益生菌制劑,被廣泛應用于畜禽飼料工業(yè)。而飼用益生菌制劑是以有效的活菌數作為重要指標,產品中必須含有相當數量的活菌才能發(fā)揮作用。但是,隨著保存時間的延長,活菌數量不斷減少,其有效活菌數降低,影響其使用效果[7]。但枯草芽孢桿菌所特有的芽孢擁有非常驚人的休眠能力,普通條件下可保存幾年至幾十年的活性,可有效延長貯存期。

    然而枯草芽孢桿菌飼用益生菌制劑芽孢產率低的問題依舊存在。并且國內枯草芽孢桿菌多采用固體發(fā)酵方式[8-10]進行生產,原料成本高、靈活性差,不便于機械化生產,而且菌體存活率和芽孢產率相對較低[11]。相較而言,液體發(fā)酵技術所采用的培養(yǎng)基原料來源廣泛、價格低廉,生產效率高,更有利于大規(guī)模生產,開發(fā)潛力大[12-13]。

    通過優(yōu)化枯草芽孢桿菌液體培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件,以期獲得較高芽孢產率保證菌體活性,為飼用益生菌制劑生產企業(yè)提供參考依據。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌種和培養(yǎng)基

    菌種:枯草芽孢桿菌,青島農業(yè)大學中韓食品研究中心提供。

    菌種活化培養(yǎng)基:營養(yǎng)瓊脂(NA) 3.3 g,無水氯化鈣0.005 g,七水硫酸鎂0.01 g,四水氯化錳0.01 g,蒸餾水100 mL。

    液體種子培養(yǎng)基:營養(yǎng)肉湯(NB) 1.8 g, 無水氯化鈣0.007 5 g,七水硫酸鎂0.01 g,四水氯化錳0.02 g,蒸餾水100 mL。

    1.1.2 儀器和試劑

    YXQ-LS-50SII型立式壓力蒸汽滅菌器、HPX-9272MBE型電熱恒溫培養(yǎng)箱、JHT系列凈化工作臺、B203LED型生物顯微鏡、SHA-C型水浴恒溫振蕩器。試驗所用試劑均為國產分析純,所用水均為二次蒸餾水。

    1.2 方法

    1.2.1 菌種活化

    將放置在4℃冰箱內保藏的枯草芽孢桿菌轉接至固體基礎培養(yǎng)基中,在45℃恒溫下培養(yǎng)24 h。

    1.2.2 液體培養(yǎng)

    沖洗固體平板,將活化后菌種轉接至液體培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基中,按照液體基礎培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)。

    液體基礎培養(yǎng)條件:轉速100 r/min,溫度45℃,初始pH值7,接種量2%,裝液量100 mL/250 mL,培養(yǎng)時間3 d。

    1.2.3 鏡檢

    固體培養(yǎng):利用五點取樣法從固體平板中取菌至無菌離心管內,制成菌懸液搖勻待用。

    液體培養(yǎng):吸取200μL菌體至無菌離心管內,制成菌懸液搖勻待用。

    蘸取菌懸液至載玻片上,火焰固定,滴適量孔雀石綠,染色5 min,沖洗,待干后滴入適量番紅染液染色5 min,沖洗晾干待用。

    在100倍油鏡下記錄細菌數與芽孢數,計算芽孢產率。

    芽孢產率計算方法見公式(1)。

    式中:A——芽孢產率,%;

    a——芽孢個數,106CFU/mL;

    b——菌體個數,106CFU/mL。

    1.3 設計

    1.3.1 培養(yǎng)基配方優(yōu)化單因素試驗

    (1) 不同MnCl2·4H2O用量對芽孢產率的影響。選取 5個 MnCl2·4H2O 用量 0.30,0.35,0.40,0.45,0.50 g,置于100 mL培養(yǎng)基,按照基礎培養(yǎng)方法進行培養(yǎng),染色鏡檢,記錄芽孢數和菌體數,計算芽孢產率。

    (2) 不同MgSO4·7H2O用量對芽孢產率的影響。選取 5 個 MgSO4·7H2O用量 0.3,0.4,0.5,0.6,0.7 g,置于100 mL培養(yǎng)基,按照基礎培養(yǎng)方法進行培養(yǎng),染色鏡檢,記錄芽孢數和菌體數,計算芽孢產率。

    (3) 不同CaCl2用量對芽孢產率的影響。選取6個不同 CaCl2用量 0,0.05,0.10,0.15,0.20,0.25 g置于100 mL培養(yǎng)基,按照基礎培養(yǎng)方法進行培養(yǎng),染色鏡檢,記錄芽孢數和菌體數,計算芽孢產率。

    (4) 不同K2HPO4·3H2O用量對芽孢產率的影響。選取 6 個 K2HPO4·3H2O 用量 0,0.10,0.20,0.30,0.40,0.50 g,置于100 mL培養(yǎng)基,按照基礎培養(yǎng)方法進行培養(yǎng),染色鏡檢,記錄芽孢數和菌體數,計算芽孢產率。

    1.3.2 培養(yǎng)基配方優(yōu)化的正交試驗

    根據單因素試驗結果以芽孢產率為指標,設計四因素三水平L9(34)正交試驗,確定最適培養(yǎng)基配方。

    1.3.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗

    (1) 不同初始pH值對芽孢產率的影響。選取4,5,6,7,8,9為初始pH值。使用1.3.2所得最佳培養(yǎng)基配方,按照基礎培養(yǎng)方法進行培養(yǎng),染色鏡檢,記錄芽孢數和菌體數,計算芽孢產率。

    (2)不同裝液量對芽孢產率的影響。選取50,75,100,125,150,250 mL 6種裝液量。使用1.3.2所得最佳培養(yǎng)基配方,按照液體培養(yǎng)方法進行培養(yǎng),染色鏡檢,記錄芽孢數和菌體數,計算芽孢產率。

    (3)不同培養(yǎng)時間對芽孢產率的影響。選取1,2,3,4,5 d 5種培養(yǎng)時間。使用1.3.2所得最佳培養(yǎng)基配方,按照液體培養(yǎng)方法進行培養(yǎng),染色鏡檢,記錄芽孢數和菌體數,計算芽孢產率。

    (4) 不同接種量對芽孢產率的影響。選取1%,2%,4%,6%,8%,10%6種接種量。使用1.3.2所得最佳培養(yǎng)基配方,按照液體培養(yǎng)方法進行培養(yǎng),染色鏡檢,記錄芽孢數和菌體數,計算芽孢產率。

    1.3.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗

    根據單因素試驗結果以芽孢產率為指標,設計四因素三水平L9(34)正交試驗,確定最適液體培養(yǎng)條件。

    2 結果與分析

    2.1 培養(yǎng)基配方優(yōu)化單因素試驗結果

    2.1.1 不同MnCl2·4H2O用量對芽孢產率的影響

    錳離子是細胞中許多酶的激活劑,有利于枯草芽孢桿菌芽孢的生成[13]。

    不同MnCl2·4H2O用量對芽孢產率的影響見圖1。

    由圖1可知,隨著MnCl2·4H2O用量的增加,枯草芽孢桿菌芽孢產率呈現先升高后降低的趨勢。MnCl2·4H2O用量達到0.45 g時,芽孢產率達到48.1%,對枯草芽孢桿菌芽孢的生長顯現促進作用。因此,選取MnCl2·4H2O最佳用量為0.45 g。

    圖1 不同MnCl2·4H2O用量對芽孢產率的影響

    2.1.2 不同MgSO4·7H2O用量對芽孢產率的影響

    鎂離子和硫離子,作為細胞中重要的酶激活劑,隨著添加量的變化會對菌體及芽孢的生長會產生不同的影響,根據結果分析枯草芽孢桿菌產率變化。

    不同MgSO4·7H2O用量對芽孢產率的影響見圖2。

    圖2 不同MgSO4·7H2O用量對芽孢產率的影響

    由圖2可知,當MgSO4·7H2O用量為0.5 g時,芽孢產率達到55.2%,使芽孢產率得到顯著提升。但超過此用量,芽孢產率便開始降低,對芽孢生長產生不利影響。因此,選取MgSO4·7H2O最佳用量為0.5 g。

    2.1.3 不同CaCl2用量對芽孢產率的影響

    鈣離子是某些胞外酶的穩(wěn)定劑、蛋白酶等的輔因子,也是細菌形成芽孢和某些真菌形成孢子所需要的重要元素[14],分析枯草芽孢產率的變化。

    不同CaCl2用量對芽孢產率的影響見圖3。

    圖3 不同CaCl2用量對芽孢產率的影響

    由圖3可知,在一定范圍內,隨著CaCl2用量升高,菌種產芽孢數量越多,芽孢產率也呈現上升趨勢。用量升至0.15g時,芽孢產率高達57.7%,對芽孢生長具有明顯促進作用;當繼續(xù)增加用量,該無機鹽對芽孢生長開始出現抑制作用,不利于芽孢產率的提升。因此,CaCl2最佳添加量為0.15 g。

    2.1.4 不同K2HPO4·3H2O用量對芽孢產率的影響

    不同K2HPO4·3H2O用量對芽孢產率的影響見圖4。

    圖4 不同K2HPO4·3H2O用量對芽孢產率的影響

    由圖4可知,最適K2HPO4·3H2O用量為0.2 g,此時芽孢產率為59.3%,對芽孢生長起到顯著促進作用,用量過高或過低都不利于芽孢的生長,所以選擇K2HPO4·3H2O最佳用量為0.2 g。

    2.2 最適生長培養(yǎng)基確定

    根據以上單因素試驗結果,以芽孢產率為指標考查錳離子、鎂離子、鈣離子、鉀離子的不同用量對芽孢產率的影響,設計四因素三水平L9(34)正交試驗,確定最適培養(yǎng)基條件。

    L9(34)正交試驗因素與水平設計見表1。

    表1 L(934)正交試驗因素與水平設計/g

    L9(34)正交設計及結果見表2,SPSS方差分析結果見表3。

    表2 L9(34)正交設計及結果

    由表2可知,極差R值的大小為D>B>C>A,即影響枯草芽孢桿菌芽孢產率的主次順序為鉀離子>鎂離子>鈣離子>錳離子;正交試驗方差分析結果(表3) 顯示,各因素各水平差異極顯著(p<0.01),得出A1B1C2D3為最優(yōu)水平。

    表3 SPSS方差分析結果

    對最優(yōu)水平A1B1C2D3與試驗結果最優(yōu)A2B1C2D3進行驗證對比試驗,A1B1C2D3的芽孢產率為64.8%,A2B1C2D3的芽孢產率為64.59%,表明A1B1C2D3的液體培養(yǎng)基更佳,最佳培養(yǎng)基組合為每100 mL培養(yǎng)基中錳離子0.4 g,鎂離子0.4 g,鈣離子0.15 g,鉀離子0.3 g。

    2.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗結果

    2.3.1 不同初始pH值對芽孢產率的影響

    不同初始pH值對芽孢產率的影響見圖5。

    圖5 不同初始pH值對芽孢產率的影響

    由圖5可知,隨著培養(yǎng)基初始pH值的增加,產孢率呈現先上升后下降的趨勢,pH值為7時芽孢產率最大達64%,pH值過高或過低培養(yǎng)條件下芽孢產率均偏低,得出液體培養(yǎng)最優(yōu)pH值為7。

    2.3.2 不同裝液量對芽孢產率的影響

    不同裝液量對芽孢產率的影響見圖6。

    圖6 不同裝液量對芽孢產率的影響

    由圖6可知,隨著裝液量的增加,產孢率呈現先上升后下降的趨勢;最適液體培養(yǎng)枯草芽孢桿菌芽孢生長的裝液量為100 mL/250 mL,此時枯草芽孢桿菌芽孢產率最大,為65%。

    2.3.3 不同培養(yǎng)時間對芽孢產率的影響

    不同培養(yǎng)時間對芽孢產率的影響見圖7。

    圖7 不同培養(yǎng)時間對芽孢產率的影響

    由圖7可知,隨著培養(yǎng)時間的增加,產孢率呈現先上升后下降的趨勢,最適液體培養(yǎng)枯草芽孢桿菌芽孢生長的培養(yǎng)時間為3 d,此時枯草芽孢桿菌芽孢產率最大,為67.7%。

    2.3.4 不同接種量對芽孢產率的影響

    不同接種量對芽孢產率的影響見圖8。

    圖8 不同接種量對芽孢產率的影響

    由圖8可知,隨著接種量的增加,產孢產率出現2個峰值,即接種量為2%時芽孢產率為68.6%,接種量為8%時芽孢產率為66.7%,考慮節(jié)省成本,選取2%為最佳接種量。

    2.4 最適培養(yǎng)條件確定

    設計四因素三水平L9(34)正交試驗,確定最適培養(yǎng)條件。

    L9(34)正交試驗因素與水平設計見表4。

    表1 L9(34)正交試驗因素與水平設計

    L9(34)正交試驗設計及結果見表5,SPSS方差分析結果見表6。

    由表 5 可知,極差 R'值大小為 B'>D'>C'>A',即影響枯草芽孢桿菌芽孢產率的主次順序為接種量>培養(yǎng)時間>初始pH值>裝液量;正交試驗方差分析結果顯示,除裝液量外,各因素各水平差異極顯著(p<0.01),得出 A'3B'3C'2D'2為最優(yōu)水平。

    表5 L9(34)正交試驗設計及結果

    表6 SPSS方差分析結果

    對最優(yōu)水平A'3B'3C'2D'2與試驗結果最優(yōu)A'3B'3C'2D'1進行驗證對比試驗,A'3B'3C'2D'2的芽孢產率為72.10%,A'3B'3C'2D'1的芽孢產率為70.50%,表明A'3B'3C'2D'2的液體培養(yǎng)條件更佳,即最優(yōu)培養(yǎng)條件組合為裝液量125 mL/250 mL,接種量4%,初始pH值7,培養(yǎng)時間3 d。

    3 結論

    枯草芽孢桿菌芽孢生長的培養(yǎng)基配方為營養(yǎng)肉湯1.8 g,無水氯化鈣0.15 g,七水硫酸鎂0.40 g,四水氯化錳0.40 g,硫酸氫二鉀0.30 g每100 mL培養(yǎng)基;最佳產孢培養(yǎng)條件為初始pH值7,裝液量125 mL/250 mL,培養(yǎng)時間3 d,接種量4%,使液體培養(yǎng)枯草芽孢桿菌芽孢產率最終能達到72.1%。

    結果表明,在培養(yǎng)基優(yōu)化方面鉀元素對芽孢產率影響最為顯著,添加適當的K2HPO4·3H2O有助于維持和調節(jié)細胞滲透壓的,對于芽孢的生長可能產生不同程度的促進作用,在培養(yǎng)條件方面接種量對芽孢產率影響最為顯著,接種量會直接影響發(fā)酵情況,過大會引起溶氧不足,最佳接種量會有利促進芽孢產率的提升。

    數據可作為工業(yè)生產的參考,部分培養(yǎng)基配方與培養(yǎng)條件還可進行進一步的探索研究,若應用于生產中,將會為飼料生產企業(yè)節(jié)約成本,增加收益。

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