Mmu-miR-124靶基因預(yù)測及通過GSK3B調(diào)控神經(jīng)發(fā)育的可能性：基于生物信息學(xué)和qPT-PCR分析

蔣云鳳 孫宇

哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育是一個貫穿始終的復(fù)雜過程。異常的神經(jīng)發(fā)育可能會導(dǎo)致終身殘疾甚至死亡[1-2]。在神經(jīng)發(fā)生過程中，神經(jīng)干細(xì)胞有可能產(chǎn)生三種細(xì)胞亞系，包括星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元[3-4]。神經(jīng)元是一類由胞體、軸突和樹突組成的雙極性細(xì)胞，神經(jīng)元軸突的發(fā)育過程包括極性的建立、軸突導(dǎo)向和軸突的延伸分支，這些發(fā)育過程對于神經(jīng)元的發(fā)育以及腦建立神經(jīng)環(huán)路至關(guān)重要[5]。軸突導(dǎo)向在發(fā)育過程中引導(dǎo)軸突生長[6]，并控制成年突觸連接的結(jié)構(gòu)可塑性。因此，進(jìn)一步探究軸突導(dǎo)向的失調(diào)如何導(dǎo)致疾病發(fā)生，以及其分子機(jī)制，將有助于神經(jīng)類疾病治療策略的進(jìn)一步發(fā)展。

核微小RNA（microRNA/miRNA）是一類長約18～23 核苷酸的非編碼小RNA，對靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平及翻譯水平調(diào)控，能特異性介導(dǎo)靶mRNA 降解或者抑制靶蛋白的翻譯[7]。大量文獻(xiàn)表明，miRNA參與多種生物學(xué)功能，如細(xì)胞分化、增殖、凋亡、遷移和轉(zhuǎn)移，調(diào)控多種疾病。因此，實(shí)現(xiàn)miRNA 藥物的安全靶治療具有很大的價(jià)值和前景[8-9]。Mmu-miR-124是已知大腦中表達(dá)最豐富和最具特征的miRNA。相關(guān)研究表明，miR-124 通過靶基因參與神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)元分化過程[10-12]；miR-124/PTPN1 信號通路參與老年性癡呆的突觸和記憶缺陷[13]；miR-124 也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾?。ㄈ缟窠?jīng)膠質(zhì)瘤、腦卒中等）有價(jià)值的診斷和預(yù)后指標(biāo)[14-15]。因此，研究Mmu-miR-124 的靶基因及其在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中軸突導(dǎo)向的相關(guān)信號通路具有很大的應(yīng)用價(jià)值。

本研究通過生物學(xué)分析，預(yù)測Mmu-miR-124的靶基因，并對其靶基因集合進(jìn)行Gene Ontology（GO）、Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes（KEGG）、Reactome Pathway 以及Protein-protein interaction（PPI）神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析，為尋找Mmu-miR-124在神經(jīng)發(fā)育中靶基因的功能研究提供理論基礎(chǔ)，并通過qRT-PCR 初步驗(yàn)證生物學(xué)分析的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級E14.5 C57 小鼠（共2 只）購買自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可為SCXK（滬）2018-0006。本實(shí)驗(yàn)符合實(shí)驗(yàn)動物倫理操作規(guī)范，上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物使用許可為SYXK（滬）2016-0016。

1.1.2 主要試劑和器材

DMEM/F12 培養(yǎng)基、B27 無血清補(bǔ)充劑、N_2 supplement、bFGF、EGF、多聚賴氨酸P6407-5MG、0.25%胰酶、Trizol（Invitrogen，美國）；Prime-Script RT 試劑（Takara 公司，）。

超凈工作臺、細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher，美國），多功能酶標(biāo)儀（Bio Tek，美國），倒置相差顯微鏡（Nikon，日本），實(shí)時熒光定量PCR 儀QuantStudio（ABI，美國）。

1.2 生物信息分析

1.2.1 Mmu-miR-124 的堿基序列

運(yùn)用UCSC 基因組在線瀏覽工具（http://genome.ucsc.edu/）分析Mmu-miR-124 在基因組中的位置及保守性。運(yùn)用mirbase（http://mirbase.org/index.shtml）查詢Mmu-miR-124 的堿基序列。

1.2.2 預(yù)測可能的靶點(diǎn)基因

目標(biāo)基因的選擇對于表征miRNA 的功能至關(guān)重要。本研究使用StarBase（http://starbase.sysu.edu.cn）數(shù)據(jù)庫預(yù)測Mmu-miR-124 的靶基因，選擇mi-Randa（http://www.microrna.org/）、TargetScan（http://www.targetscan.org/）、microT、miRmap、PITA、RNA22、PicTar 中至少4 個軟件重合預(yù)測的基因，納入最后的統(tǒng)計(jì)。

1.2.3 基因本體論和通路富集分析

基于至少3 個數(shù)據(jù)庫獲得靶點(diǎn)基因后，通過DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）在線工具進(jìn)行GO分析，識別靶點(diǎn)基因的功能類別，包括生物過程（BP）、分子功能（MF）和細(xì)胞成分（CC）。同時，進(jìn)行KEGG pathway 富集分析，分析這些靶基因可能富集的信號通路。

1.2.4 整合蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

交互基因檢索工具（STRING）數(shù)據(jù)庫是一種在線的蛋白質(zhì)交互（PPI）信息評價(jià)工具。為了評估靶點(diǎn)基因之間的交互關(guān)系，點(diǎn)基因被上傳到STRING（版本10.5；http://www.string-db.org/），然后利用Cytoscape 軟件構(gòu)建PPI 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過其插件MCODE 對蛋白網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，根據(jù)蛋白之間相互作用程度（Degree）篩選出最有意義的30 個樞紐基因（hub gene）。此外，通過與KEGG 通路中的軸突導(dǎo)向通路的主要基因進(jìn)行重合，以獲得關(guān)鍵基因。

1.3 實(shí)時熒光定量PCR 分析

1.3.1 神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)

將E14.5 C57 小鼠胎鼠腦組織取出，加入0.25%胰酶，在培養(yǎng)箱中消化18 min。加入10 mL 含10%FBS 的接種培養(yǎng)基終止消化。過尼龍網(wǎng)去除組織碎片。將上清置于離心機(jī)中，1 500 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清，用含有1%N2 的DMEM/F12 重懸。將細(xì)胞以0.1×106cells/mL 的密度接種于多聚賴氨酸（Poly-D-lysine，PDL）（50 μg/mL）包被的培養(yǎng)板中，每2～3 天加液一次。神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)基中含有20 ng/mL 的bFGF、EGF 和2%B27。置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中使用倒置相差顯微鏡觀察神經(jīng)干細(xì)胞的生長情況。

1.3.2 qRT-PCR

按照說明書分別于第3、5、7、10 天提取神經(jīng)干細(xì)胞的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄使用Prime-Script RT 試劑逆轉(zhuǎn)錄重組特定的cDNA；反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃15 min，85 ℃5 sec。每個目標(biāo)基因的表達(dá)水平檢測使用一個標(biāo)準(zhǔn)的SYBR-Green 方法，以cDNA 為模板，擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃30 sec；變性95 ℃5 sec；退火60 ℃30 sec，延伸72 ℃30 sec，重復(fù)40 個循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因的相對表達(dá)水平（表1）。

表1 熒光定量PCR 引物序列Table 1 Realtime-PCR primer sequences

2 結(jié)果

2.1 Mmu-miR-124 的位置

首次在小鼠身上發(fā)現(xiàn)的成熟Mmu-miR-124，在小、大鼠和人類中完全同源。通過UCSC 基因組在線瀏覽工具得到Mmu-miR-124 在基因組中的位置（圖1）。

圖1 Mmu-miR-124 在基因組中所處的位置Fig.1 The location of Mmu-miR-124 in the genome

2.2 Mmu-miR-124 的靶基因預(yù)測

運(yùn)用StarBase（http://starbase.sysu.edu.cn）數(shù)據(jù)庫預(yù)測Mmu-miR-124 的靶基因，并選擇miRanda（http://www.microrna.org/）、TargetScan（http://www.targetscan.org/）、microT、miRmap、PITA、RNA22、PicTar中至少4 個軟件重合預(yù)測的基因，最終共納入775個基因進(jìn)入統(tǒng)計(jì)。

2.2.1 Mmu-miR-124 靶基因的GO 分析

將數(shù)據(jù)庫預(yù)測的775 個靶基因上傳至DAVID網(wǎng)站進(jìn)行GO 功能分析，并列舉出生物過程（BP）、分子功能（MF）和細(xì)胞成分（CC）的前5 個重要通路。GO 結(jié)果表明，Mmu-miR-124 靶基因在生物功能方面主要與內(nèi)吞作用、翻譯負(fù)調(diào)節(jié)和細(xì)胞形狀調(diào)節(jié)有關(guān)；在分子功能方面主要與磷脂酰肌醇綁定、轉(zhuǎn)錄激活子活性、RNA 聚合酶II 核心啟動子近端區(qū)序列特異性結(jié)合和mRNA 3'-UTR 綁定有關(guān)；在細(xì)胞成分方面主要與皺褶、核膜和刷毛緣有關(guān)（表2）。

2.2.2 Mmu-miR-124 靶基因的Reactome 通路分析

將數(shù)據(jù)庫預(yù)測的775 個靶基因上傳至Reactome pathway Database（https://www.reactome.org/），Reactome 通路分析，結(jié)果顯示：靶點(diǎn)基因通路主要富集于RNA 聚合酶iii 轉(zhuǎn)錄終止、FGFR2 信號通路和IRS 介導(dǎo)的信號通路（圖2）。

2.2.3 Mmu-miR-124 靶基因的KEGG 通路分析

將775 個靶基因上傳至DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）網(wǎng)站行KEGG 分析，結(jié)果顯示：通路主要富集于軸突導(dǎo)向、長時程壓抑和鞘脂類代謝（表3）。

2.2.4 Mmu-miR-124 靶基因蛋白間的相互作用預(yù)測

通過字符串將預(yù)測的靶點(diǎn)基因上傳至網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行PPI 分析，并篩選出前30 個樞紐基因與KEGG 通路中的軸突導(dǎo)向通路的主要基因進(jìn)行重合并得到關(guān)鍵基因：GSK3B、NRAS 和ITGB1。

2.3 熒光定量實(shí)時PCR 結(jié)果

在神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，倒置顯微鏡觀察神經(jīng)干細(xì)胞的生長，分別于第3、5、7、10 天提取神經(jīng)干細(xì)胞的RNA，通過qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，ITGB1 不存在，隨時間延長，Mmu-miR-124 表達(dá)增加，GSK3B表達(dá)略下降，NRAS 表達(dá)不變。Mmu-miR-124 與GSK3B 的堿基互補(bǔ)配對序列的配對預(yù)測提示了兩者之間可能存在緊密的聯(lián)系（圖3、4）。

表2 生物過程、分子功能和細(xì)胞成分的前5 個重要的GO 通路Table 2 Top 5 significant GO terms of BP,MF and CC

圖2 靶點(diǎn)基因的Reactome 通路Fig.2 Reactome pathway of target genes

表3 前10 個關(guān)鍵的KEGG 通路Table 3 Top 10 significant Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathways

圖3 在神經(jīng)發(fā)育中mmu-miR-124 及其靶基因的表達(dá)變化Fig.3 Changes in the relative expression of mmu-miR-124 and its target genes during the neurodevelopment

圖4 Mmu-miR-124 與GSK3B 的堿基配對預(yù)測Fig.4 Prediction of base pairing between mmu-miR-124 and GSK3B

3 討論

Mmu-miR-124 是大腦中表達(dá)豐富和功能強(qiáng)大的特異性microRNA，其通過多種機(jī)制參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生，也是神經(jīng)系統(tǒng)疾病診斷和治療的重要指標(biāo)之一[14，16－17]。本研究通過預(yù)測Mmu-miR-124 的靶基因，并通過生物信息學(xué)的手段對其靶基因進(jìn)行KEGG 通路分析，得到前10 個關(guān)鍵的KEGG 通路，其中，前兩個是與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的通路：Axon guidance 和Long-term depression 通路，并將Axon guidance 通路中的14 個關(guān)鍵基因與PPI 蛋白網(wǎng)絡(luò)的前30 個Hub 基因取交集得到重合的3 個關(guān)鍵基因，并對關(guān)鍵基因進(jìn)行初步的qRT-PCR 驗(yàn)證。

許多神經(jīng)疾病的特征是神經(jīng)元連接的結(jié)構(gòu)改變，從一開始的突觸變化到整個軸突束的丟失以及重新連接。這種擾亂連接結(jié)構(gòu)過程的分子機(jī)制尚不明確，然而，最新的研究結(jié)果表明，軸突導(dǎo)向蛋白在連接結(jié)構(gòu)紊亂中發(fā)揮了重要的作用[6，18－19]。軸突導(dǎo)向蛋白在神經(jīng)發(fā)育過程中引導(dǎo)軸突生長，并控制著成熟的突觸連接以及結(jié)構(gòu)的可塑性。研究證明，MmumiR-124 參與神經(jīng)發(fā)育的多個過程。本研究通過對Mmu-miR-124 的靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，其可能在軸突導(dǎo)向通路中起到關(guān)鍵的作用。通過生物信息學(xué)預(yù)測，并對所得的關(guān)鍵基因進(jìn)行qRT-PCR初步驗(yàn)證，我們認(rèn)為Mmu-miR-124 可能通過絲氨酸/蘇氨酸激酶糖原合酶激酶-3（GSK3B）調(diào)控神經(jīng)發(fā)育。研究表明，GSK3B 是多種細(xì)胞通路的主調(diào)控因子，包括胰島素信號和糖原合成、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號、Wnt 信號、神經(jīng)遞質(zhì)信號和微管動力學(xué)[20]。同時，GSK3B 與多種人類疾病有關(guān)，包括老年癡呆癥、雙相情感障礙、非胰島素依賴型糖尿病、心臟肥大和癌癥[21-23]。因此，Mmu-miR-124 很可能通過對靶基因GSK3B 的調(diào)控影響神經(jīng)發(fā)育。

最近的研究證實(shí)，Mmu-miR-124 在神經(jīng)系統(tǒng)以及腫瘤疾病中具有重要的生物學(xué)功能[13，16－17]，對Mmu-miR-124 靶基因功能的認(rèn)識還有待進(jìn)一步的探索和研究。本研究采用靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫得到可信度較高的靶基因集合，并對靶基因進(jìn)行GO 功能注釋和KEGG 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析，有助于對Mmu-miR-124 所參與的生物學(xué)過程有一個較全面的認(rèn)識，為進(jìn)一步深入研究其功能奠定了基礎(chǔ)。但由于預(yù)測靶基因過程中不可避免地存在假陽性率，所以對預(yù)測得到的靶基因及其發(fā)揮的生物學(xué)功能需要進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。