電轉(zhuǎn)方法用于modRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的初步研究

陳茂林 王會(huì)景 艾雪峰 顏冰倩 宮藝奇 譚瑤 付煒 王偉

中心法則是現(xiàn)代生物學(xué)的基礎(chǔ)，DNA 和RNA均可作為遺傳物質(zhì)，均可指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。目前的研究多集中于DNA，而mRNA 相較于DNA 有以下優(yōu)勢(shì)：①mRNA 具有脈沖式表達(dá)的特性；②mRNA 安全性高，因其無(wú)需整合到宿主基因組中，故可排除插入誘變的風(fēng)險(xiǎn)[1-2]；③mRNA 具有快速表達(dá)的特性[3]，相較于DNA，mRNA 省略了轉(zhuǎn)錄步驟，因此可以更快地合成蛋白質(zhì)。

自1961 年發(fā)現(xiàn)mRNA[4]至1992 年AVP mRNA[5]用于治療大鼠尿崩癥，關(guān)于mRNA 的應(yīng)用十分有限。這是由于mRNA 自身存在兩個(gè)限制因素：①不穩(wěn)定性和翻譯效率低。mRNA 在生理?xiàng)l件下不穩(wěn)定，易被細(xì)胞和細(xì)胞外核糖核酸酶（RNase）迅速降解，從而導(dǎo)致翻譯效率低下；②免疫原性高，mRNA 具有高度的免疫原性，進(jìn)入細(xì)胞后可激活細(xì)胞Toll 樣受體（TLRs）導(dǎo)致炎癥和抑制蛋白質(zhì)翻譯[6-9]。直到2005年，Karik'o 等通過(guò)在體外化學(xué)修飾mRNA 的核苷酸，產(chǎn)生了更穩(wěn)定及更小免疫原性的modRNA[10-12]，從而解決了mRNA 作為表達(dá)載體易被降解和高度免疫原性的問(wèn)題，開(kāi)啟了modRNA 應(yīng)用的大門。modRNA（Modified messenger ribonucleic acid，合成修飾的信使核糖核酸）是一項(xiàng)在體外對(duì)mRNA 的核苷酸進(jìn)行化學(xué)修飾，以逃避機(jī)體固有免疫并表達(dá)目標(biāo)蛋白的技術(shù)。2011 年有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)odRNA 在體內(nèi)成功表達(dá)目標(biāo)蛋白[13]，并有報(bào)道利用modRNA 技術(shù)研發(fā)出對(duì)抗寨卡病毒的疫苗。此外，modRNA 目前已被應(yīng)用于心、肝、胰、肺等器官的修復(fù)治療和去分化誘導(dǎo)產(chǎn)生iPS 細(xì)胞[14-18]。

目前，modRNA 應(yīng)用主要為體內(nèi)轉(zhuǎn)染，而體內(nèi)轉(zhuǎn)染具有兩個(gè)局限性：①轉(zhuǎn)染試劑多為脂質(zhì)體，有一定的生物毒性；②體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率低下導(dǎo)致表達(dá)效率受限[19]。鑒于體內(nèi)轉(zhuǎn)染的缺點(diǎn)，本研究設(shè)想在體外利用modRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，再結(jié)合細(xì)胞治療的方法，將修飾過(guò)的細(xì)胞重新輸回體內(nèi)。電轉(zhuǎn)染是通過(guò)高強(qiáng)度的電場(chǎng)作用，瞬時(shí)提高細(xì)胞膜的通透性，從而吸收周圍介質(zhì)中的外源分子。電轉(zhuǎn)法操作簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高，無(wú)毒，對(duì)于各種類型細(xì)胞均可轉(zhuǎn)染，但對(duì)于不同種類的細(xì)胞，電轉(zhuǎn)染參數(shù)各不相同，包括電壓、脈沖時(shí)間、溫度、細(xì)胞狀態(tài)和數(shù)量等均會(huì)影響電轉(zhuǎn)染的效率[20]。故本研究擬探討電轉(zhuǎn)方法用于modRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的可行性，并篩選出人成纖維細(xì)胞、Hela 細(xì)胞、293T 細(xì)胞和3T3 細(xì)胞電轉(zhuǎn)所需的最適電壓和脈沖時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

人成纖維細(xì)胞來(lái)源于兒童包皮環(huán)切術(shù)后廢棄的包皮組織，由上海交通大學(xué)附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心泌尿外科提供，家長(zhǎng)對(duì)治療及實(shí)驗(yàn)均知情同意。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

DMEM 高糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（Hyclone，美國(guó)）。

Leica 生物倒置顯微鏡DMI3000 B（成貫儀器有限公司）；BD FACS Canto Ⅱ流式細(xì)胞儀、Lonza 電轉(zhuǎn)儀（上海普迪生物技術(shù)有限公司）；Celetrix 電轉(zhuǎn)儀（深圳市達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 modRNA 的設(shè)計(jì)、制備

參照文獻(xiàn)[21]查找到相應(yīng)的EGFP（Enhanced green fluorescent protein，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白）、nGFP（Nuclear GFP，核綠色熒光蛋白）、mCherry 的CDS（Codig sequence，編碼序列）序列；在CDS 序列前后添加5' 和3' 非翻譯區(qū)等序列，之后插入到PUC57 質(zhì)粒載體；將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α 大腸桿菌中擴(kuò)增；提取質(zhì)粒并使用限制性內(nèi)切酶將質(zhì)粒線性化，對(duì)所需片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；PCR 的產(chǎn)物體外轉(zhuǎn)錄后純化并通過(guò)Nanodrop 和生物分析儀進(jìn)行RNA 濃度和質(zhì)量控制。

1.2.2 人成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)

收取包皮組織3～5 塊，超凈臺(tái)中用含5%青-鏈霉素的PBS 緩沖液沖洗3～5 遍。剪去除包皮皮下附著的脂肪、毛細(xì)血管等，將組織剪成2 mm×1 cm 的長(zhǎng)條形組織塊，0.3%的中性蛋白酶浸沒(méi)，4 ℃冰箱過(guò)夜消化；次日取出，將包皮的表皮層用鑷子分離，只留下真皮組織，將其剪成約1 mm×1 mm×1 mm 大小，0.3%Ⅳ型膠原酶浸沒(méi)，37 ℃搖床200 r/min 消化2～3 h。待組織完全消化，用40 μm 孔徑的細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液，離心棄上清，PBS 重懸，離心再棄上清。加入2 mL 配制好的完全培養(yǎng)基（10%FBS+DMEM 高糖溶液+雙抗）制成細(xì)胞懸液，按每塊包皮2～3 個(gè)10 cm 皿的密度接種于配制好的完全培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)，隔天換液，細(xì)胞融合達(dá)80%～90%時(shí)傳代，第2～4 代用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 人成纖維細(xì)胞電轉(zhuǎn)EGFP modRNA 條件篩選

每6×105個(gè)人成纖維細(xì)胞加入20 μL 電轉(zhuǎn)液和2 μg EGFP modRNA。取20 μL 混合液加入電轉(zhuǎn)杯中，保持脈沖時(shí)間30 ms 不變，分別于435 V、440 V、445 V 電壓下電轉(zhuǎn)，將電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞轉(zhuǎn)入24 孔中，加入完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2下培養(yǎng)，24 h后熒光顯微鏡下觀察拍照，并通過(guò)流式檢測(cè)儀檢測(cè)EGFP 熒光強(qiáng)度和表達(dá)效率。SPSS 分析結(jié)果，確定最適電壓。保持電壓不變，分別于20 ms、30 ms、40 ms脈沖時(shí)間下電轉(zhuǎn)，將電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞轉(zhuǎn)入24 孔中，加入完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2下培養(yǎng)，24 h 后熒光顯微鏡下觀察拍照，并通過(guò)流式檢測(cè)儀檢測(cè)EGFP熒光強(qiáng)度和表達(dá)效率。SPSS 分析結(jié)果，確定最適脈沖時(shí)間。

為了觀察EGFP 蛋白表達(dá)隨時(shí)間變化的關(guān)系，使用最適電壓和脈沖時(shí)間向人成纖維細(xì)胞電轉(zhuǎn)EGFP modRNA，連續(xù)7 d 進(jìn)行熒光拍照及流式檢測(cè)。

1.2.4 人成纖維細(xì)胞電轉(zhuǎn)nGFP/EGFP+mCherry modRNA

每6×105個(gè)人成纖維細(xì)胞加入20 μL 電轉(zhuǎn)液和2μg nGFP modRNA；每6×105個(gè)人成纖維細(xì)胞加入1 μg EGFP、1 μg mCherry modRNA 和20 μL 電轉(zhuǎn)液；最適電壓和脈沖時(shí)間下電轉(zhuǎn)，將電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞轉(zhuǎn)入24 孔中，加入完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2下培養(yǎng)，24 h 后熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 Hela/293T/3T3 細(xì)胞電轉(zhuǎn)EGFP modRNA 條件的篩選

對(duì)于Hela 細(xì)胞，保持脈沖時(shí)間30 ms 不變，分別在415 V、425 V、435 V 電壓下電轉(zhuǎn)，確定最適電壓后，保持最適電壓不變，分別于20 ms、30 ms、40 ms脈沖時(shí)間下電轉(zhuǎn)。293T 細(xì)胞保持脈沖時(shí)間30 ms 不變，分別于390 V、400 V、410 V 電壓下電轉(zhuǎn)，確定最適電壓后，保持最適電壓不變，分別于20 ms、30 ms、40 ms 脈沖時(shí)間下電轉(zhuǎn)。3T3 細(xì)胞保持脈沖時(shí)間30 ms 不變，分別于430 V、440 V、450 V 電壓下電轉(zhuǎn)，確定最適電壓后，保持最適電壓不變，在20 ms、30 ms、40 ms 脈沖時(shí)間下電轉(zhuǎn)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每組實(shí)驗(yàn)在相同情況下重復(fù)3 次，所得數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS 20 軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以（）表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人成纖維細(xì)胞電轉(zhuǎn)EGFP modRNA 條件篩選

為了篩選電轉(zhuǎn)EGFP modRNA 入人成纖維細(xì)胞最佳的電壓和脈沖時(shí)間參數(shù)，首先固定脈沖時(shí)間，使用不同電壓電轉(zhuǎn)；再固定電壓，使用不同脈沖時(shí)間電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)后24 h，通過(guò)對(duì)不同電轉(zhuǎn)參數(shù)的人成纖維細(xì)胞進(jìn)行熒光拍照，肉眼觀察。結(jié)果顯示，使用不同電壓和脈沖時(shí)間電轉(zhuǎn)后，人成纖維細(xì)胞均有熒光蛋白表達(dá)（圖1A-F），但電壓440 V，脈沖時(shí)間30 ms時(shí)熒光強(qiáng)度最高（圖1B、E）。

流式結(jié)果顯示，2 μg EGFP modRNA 在不同電壓下轉(zhuǎn)染人成纖維細(xì)胞，435 V、30 ms 時(shí)轉(zhuǎn)染效率為93.7%±0.7%；440 V、30 ms 時(shí)轉(zhuǎn)染效率為97.3%±0.4%；445 V、30 ms 時(shí)轉(zhuǎn)染效率為94.6%±0.5%。三者差異顯著（P＜0.05），選擇440 V 作為最適電壓（圖2A-C）。

2 μg EGFP modRNA 選擇不同脈沖時(shí)間轉(zhuǎn)染人成纖維細(xì)胞，440 V、20 ms 時(shí)轉(zhuǎn)染效率為93.2%±3.2%；440 V、30 ms 時(shí)轉(zhuǎn)染效率為97.3%±0.4%；440 V、40 ms時(shí)轉(zhuǎn)染效率為81.1%±1.1%，三者差異顯著（P＜0.05）。選擇30 ms 作為最適脈沖時(shí)間（圖2D-F）。

2.2 EGFP modRNA 表達(dá)隨時(shí)間變化關(guān)系

為了觀察EGFP modRNA 表達(dá)隨時(shí)間的變化，使用最適電壓和脈沖時(shí)間向人成纖維細(xì)胞電轉(zhuǎn)EGFP modRNA 后，對(duì)人成纖維細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)7 d 的熒光拍照和流式分析。在440 V、30 ms 條件下電轉(zhuǎn)，連續(xù)7 d 熒光可觀察到熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)脈沖式表達(dá)，自電轉(zhuǎn)后12 h 到電轉(zhuǎn)后2 d，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，電轉(zhuǎn)后2 d 熒光強(qiáng)度逐漸減弱。EGFP 表達(dá)高峰時(shí)間為電轉(zhuǎn)后24～48 h，持續(xù)時(shí)間約6 d（圖3）。

連續(xù)7 天流式檢測(cè)表明：前六天EGFP 表達(dá)效率基本持續(xù)在90%以上（圖4A-G、I），電轉(zhuǎn)后3 天效率最高，為（99±0.17）%（圖4D）；EGFP modRNA的表達(dá)呈現(xiàn)為脈沖式，EGFP 熒光強(qiáng)度高峰時(shí)間為電轉(zhuǎn)后24～48 小時(shí),電轉(zhuǎn)后1 天和電轉(zhuǎn)后2 天熒光強(qiáng)度分別為6860.3±1264.6 和5896.7±163.8（圖4J）。

2.3 人成纖維細(xì)胞電轉(zhuǎn)nGFP/EGFP+mCherry modRNA

nGFP 與EGFP 作用場(chǎng)所不同，EGFP 在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用，而nGFP 具有核定位序列，特異性進(jìn)入核內(nèi)表達(dá)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，許多轉(zhuǎn)錄因子需進(jìn)入核內(nèi)發(fā)揮作用，若nGFP 可進(jìn)入核內(nèi)表達(dá)，則許多在核內(nèi)發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄因子也可制作成modRNA 形式。在440 V、30 ms 條件下電轉(zhuǎn)nGFP modRNA 入人成纖維細(xì)胞，24 h 后熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形貼壁生長(zhǎng)（圖5A），熒光下細(xì)胞核發(fā)出綠色熒光，熒光圖與DAPI 圖高度重疊（圖5B-D），說(shuō)明nGFP 可高效進(jìn)入人成纖維細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。

許多基因的調(diào)控或者疾病的治療需要多因子的協(xié)同作用。因此，本研究嘗試對(duì)一種細(xì)胞轉(zhuǎn)染兩種modRNA，評(píng)價(jià)電轉(zhuǎn)法的轉(zhuǎn)染效果，觀察單個(gè)細(xì)胞是否可電轉(zhuǎn)入兩種modRNA 并同時(shí)表達(dá)。440 V、30 ms條件下向人成纖維細(xì)胞電轉(zhuǎn)1 μg EGFP+1 μg mCherry modRNA，24 h 后熒光顯微鏡下可見(jiàn)人成纖維細(xì)胞發(fā)出綠色熒光和紅色熒光（圖6A、B），且紅色熒光和綠色熒光高度重合，紅/綠熒光與DAPI 大部分重合（圖6C、D），說(shuō)明EGFP 和mCherry 可共存于同一細(xì)胞內(nèi)并同時(shí)表達(dá)。

2.4 Hela 細(xì)胞、293T 細(xì)胞和3T3 細(xì)胞電轉(zhuǎn)EGFP modRNA 條件的篩選

為了驗(yàn)證電轉(zhuǎn)法對(duì)于不同貼壁細(xì)胞導(dǎo)入mod-RNA 的效果，使用Hela 細(xì)胞、293T 細(xì)胞和3T3 細(xì)胞導(dǎo)入EGFP modRNA，篩選最適電壓和脈沖時(shí)間的方法同前。在電壓425 V、脈沖時(shí)間30 ms 的條件下，向Hela 細(xì)胞電轉(zhuǎn)2 μg EGFP modRNA，24 h 后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色和熒光拍照，可見(jiàn)細(xì)胞呈不規(guī)則梭形貼壁生長(zhǎng)，熒光下可見(jiàn)細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，熒光圖與DAPI 圖高度重疊（圖7A-C），說(shuō)明EGFP 可在Hela 細(xì)胞中高效表達(dá)。流式檢測(cè)EGFP 表達(dá)效率高達(dá)90.8%（圖7D）。

在電壓400 V、脈沖時(shí)間30 ms 條件下，向293T細(xì)胞電轉(zhuǎn)2 μg EGFP modRNA，24 h 后進(jìn)行細(xì)胞染色和熒光拍照，可見(jiàn)細(xì)胞呈梭形貼壁生長(zhǎng)，熒光下細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，熒光圖與DAPI 圖高度重疊（圖8A-C），說(shuō)明EGFP 可在293T 細(xì)胞中高效表達(dá)。流式檢測(cè)EGFP 表達(dá)效率高達(dá)90.4%（圖8D）。

在電壓440 V、脈沖時(shí)間30 ms 條件下，向3T3細(xì)胞電轉(zhuǎn)2 μg EGFP modRNA，24 h 后進(jìn)行細(xì)胞染色和熒光拍照，可見(jiàn)細(xì)胞呈梭形貼壁生長(zhǎng)，熒光下細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，熒光圖與DAPI 圖高度重疊（圖9A-C），說(shuō)明EGFP 可在3T3 細(xì)胞中高效表達(dá)。流式檢測(cè)EGFP 表達(dá)效率高達(dá)96%（圖9D）。

圖1 不同參數(shù)電轉(zhuǎn)EGFP modRNA 后熒光強(qiáng)度Fig.1 Fluorescence intensity after electrotransfer of EGFP modRNA with different parameters

圖2 不同參數(shù)電轉(zhuǎn)EGFP modRNA 后表達(dá)效率Fig.2 Expression efficiency after electrotransfer of EGFP modRNA with different parameter

圖3 不同時(shí)間EGFP modRNA 的表達(dá)Fig.3 Expression of EGFP modRNA at different times

圖4 流式檢測(cè)表達(dá)效率和熒光強(qiáng)度Fig.4 Detection of expression efficiency and fluorescence intensity by flow cytometry

圖5 電轉(zhuǎn)nGFP modRNA 后熒光圖Fig.5 Fluorescence diagram after electroporation of nGFP modRNA

圖6 電轉(zhuǎn)EGFP+mCherry modRNA 后熒光圖Fig.6 Fluorescence diagram after electroporation of EGFP+mCherry modRNA

圖7 Hela 細(xì)胞電轉(zhuǎn)EGFP modRNA 后熒光圖Fig.7 Fluorescence of Hela cells after electroporation with EGFP modRNA

圖8 293T 細(xì)胞電轉(zhuǎn)EGFP modRNA 后熒光圖Fig.8 Fluorescence of 293T cells after electroporation with EGFP modRNA

圖9 3T3 細(xì)胞電轉(zhuǎn)EGFP modRNA 后熒光圖Fig.9 Fluorescence of 3T3 cells after electroporation with EGFP modRNA

3 討論

modRNA 是一項(xiàng)新興技術(shù)，目前實(shí)驗(yàn)中多為體內(nèi)注射[14，22]，轉(zhuǎn)染效率有限，故暫未獲得廣泛應(yīng)用。本研究嘗試在體外利用modRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，再通過(guò)細(xì)胞治療的方法回輸細(xì)胞到體內(nèi)。貼壁細(xì)胞作為動(dòng)物體內(nèi)最常見(jiàn)的細(xì)胞種類，取材方便，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，因此被作為實(shí)驗(yàn)首選材料。目前導(dǎo)入外源性基因的方法主要有葡聚糖法、病毒法、基因槍、電轉(zhuǎn)染法等。某些真核動(dòng)物細(xì)胞，如原代的T 細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和干細(xì)胞等，其特性決定了葡聚糖等化學(xué)試劑法轉(zhuǎn)染效果不佳。病毒轉(zhuǎn)染的繁瑣程序，并有潛在的危害性，因此無(wú)法大規(guī)模應(yīng)用病毒來(lái)完成這些細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)?；驑尫▽?dǎo)入的基因往往是多拷貝隨機(jī)整合到受體基因組中，可能發(fā)生多種方式的重排。電轉(zhuǎn)染法又名電穿孔法，是通過(guò)高壓脈沖在細(xì)胞膜表面產(chǎn)生一個(gè)短暫的開(kāi)放通道，從而吸收周圍介質(zhì)中的外源分子。該技術(shù)可將DNA、RNA、蛋白質(zhì)等導(dǎo)入各種類型細(xì)胞中[23-25]。由于電轉(zhuǎn)法操作簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高，無(wú)毒，對(duì)于各種類型細(xì)胞均可轉(zhuǎn)染，故本實(shí)驗(yàn)使用電轉(zhuǎn)法嘗試將modRNA 導(dǎo)入貼壁細(xì)胞。

對(duì)于貼壁細(xì)胞，首先利用成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染多種不同類型modRNA，轉(zhuǎn)染EGFP modRNA 是為了驗(yàn)證modRNA 表達(dá)產(chǎn)物可在胞質(zhì)中表達(dá)；許多轉(zhuǎn)錄因子/蛋白需在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用，由于nGFP 蛋白有一段核定位序列，需進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，因此轉(zhuǎn)染nGFP modRNA 是為了驗(yàn)證modRNA 表達(dá)產(chǎn)物可進(jìn)入胞核中表達(dá)；許多基因的調(diào)控或者疾病的治療需要多因子的協(xié)同作用，因此本研究嘗試對(duì)一種細(xì)胞進(jìn)行兩種modRNA 的電轉(zhuǎn)，以觀察單個(gè)細(xì)胞是否可以電轉(zhuǎn)入兩種modRNA 并同時(shí)表達(dá)。最后利用同一類型modRNA 轉(zhuǎn)染三種不同貼壁細(xì)胞，證實(shí)modRNA 轉(zhuǎn)染的普遍性。

對(duì)于不同種類貼壁細(xì)胞，modRNA 電轉(zhuǎn)效率存在差別，目前暫無(wú)相關(guān)的原理解釋，但電轉(zhuǎn)不同種類貼壁細(xì)胞modRNA 的表達(dá)效率均在90%以上，已達(dá)到表達(dá)目的基因的要求。

未來(lái)的臨床應(yīng)用中，modRNA 技術(shù)或可與細(xì)胞治療相結(jié)合，例如選取人皮膚成纖維細(xì)胞，體外擴(kuò)增后作為modRNA 載體，體外導(dǎo)入目標(biāo)modRNA 后，再局部注射到組織中，細(xì)胞即表達(dá)目標(biāo)蛋白，從而達(dá)到治療的目的。