SOCS2在1型糖尿病腎病腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化中的作用①

孫 翼 高永棣 董 蓉 俞佳麗 查 艷

(貴州醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室,貴陽 550004)

我國(guó)1型糖尿病研究組研究顯示，中國(guó)仍然是全球1型糖尿病(Type 1 diabetes,T1D)發(fā)病率最低的國(guó)家之一，但過去20年間，15歲以下兒童發(fā)病率增加近4倍，新發(fā)的成人病例也不容小覷[1]。糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是T1D的常見并發(fā)癥之一，也是終末期腎病的最常見原因，影響著近15%～25%的T1D患者最終發(fā)展為DN[2]。因此，積極探索與DN相關(guān)的發(fā)病機(jī)制，尋求新型有效的預(yù)防及治療策略來阻止DN向終末期腎病發(fā)展具有重要意義。

細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子(Suppressor of cytokine signaling,SOCS)主要由各種細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生，SOCS信號(hào)參與免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)[3]。細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)途徑的失調(diào)與多種自身免疫性疾病，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和T1D等的發(fā)展和發(fā)病機(jī)理相關(guān)。在T1D發(fā)病過程中，過度活化的T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子可能導(dǎo)致β細(xì)胞的破壞和死亡[4]。近年來，已有學(xué)者證明SOCS2是β細(xì)胞中胰島素原加工和胰島素分泌的有效調(diào)節(jié)劑[5]。SOCS2失衡就可能導(dǎo)致很多疾病，如心血管疾病，胰島素抵抗，癌癥和嚴(yán)重感染等[6]。然而，SOCS2在T1DN腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(Epithelial to mesenchymal transition，EMT)導(dǎo)致腎臟纖維化中的作用還尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過成功建立T1DN小鼠模型，檢測(cè)并分析SOCS2和腎臟纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，探討在T1DN發(fā)病過程中SOCS2對(duì)EMT的作用，為DN的新型治療分子提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑 STZ購(gòu)自Sigma公司，鹽酸貝那普利購(gòu)自北京諾華制藥有限公司，胰島素注射液購(gòu)自江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司。尿蛋白試劑盒購(gòu)自BioAssay Systems，兔E-Cadherin多克隆抗體、兔FN多克隆抗體、兔SOCS2多克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG均購(gòu)自MDL公司，E-Cadherin、FN、SOCS2原位雜交試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司。6周齡C57/BL6雄性小鼠(n=28,18～22 g)購(gòu)自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(軍)2012-0011。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、標(biāo)本收集 28只C57/BL6雄鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，隨機(jī)分對(duì)照組(n=7)和T1D組(n=21)，均普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。T1D組禁食24 h，自由飲水，單次空腹腹腔注射100 mg/kg 鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)，48 h后取尾靜脈血測(cè)血糖，隨機(jī)血糖測(cè)定結(jié)果≥16.7 mmol/L為T1D建模成功。將21只T1D小鼠再隨機(jī)分為T1DN組(n=7)；貝那普利+胰島素聯(lián)合組(n=7)，聯(lián)合給予皮下注射1～2 U/(kg·48 h) 胰島素和10 mg/(kg·48 h) 貝那普利灌胃8周；胰島素(Insulin)組(n=7)，皮下注射1～2 U/(kg·48 h)胰島素8周。持續(xù)給藥8周后收集24 h尿液(加防腐劑)測(cè)24 h尿蛋白。處死當(dāng)天記錄各組小鼠空腹血糖值，水合氯醛麻醉，采血灌注后，取雙腎，用10%中性甲醛溶液固定過夜，常規(guī)石蠟包埋，制成石蠟切片。

1.2.224 h尿蛋白測(cè)定 記錄24 h尿量后，用尿蛋白試劑盒(比色法)測(cè)得尿蛋白濃度，按24 h尿蛋白=尿蛋白濃度×24 h尿量，算出24 h尿蛋白。

1.2.3天狼星紅染色染色(Sirius red staining,SR) 2～3 μm石蠟切片脫蠟至水化，Weigert鐵蘇木素染液染色10 min，自來水洗，天狼星紅染液滴染1 h，自來水浸泡，脫水、透明、封片。

1.2.4免疫組織化學(xué) 4 μm石蠟切片脫蠟至水化，3%過氧化氫降低內(nèi)源性酶活性，檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)后，E-cadherin(1∶500)、FN(1∶500)、SOCS2(1∶200)抗體4℃孵育過夜，另設(shè)PBS代替一抗作陰性對(duì)照。復(fù)溫后充分洗滌，兔二步法二抗室溫孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片。每個(gè)實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。光學(xué)顯微鏡下拍照，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，用Image-Plo Plus 6.0圖像處理軟件分析，計(jì)算累積光密度IOD值。

1.2.5原位雜交 4 μm石蠟切片脫蠟至水化，3%H2O2滅活內(nèi)源性酶，暴露mRNA片段后固定。42℃預(yù)雜交4 h后，加雜交液與組織細(xì)胞中的待測(cè)核酸雜交，38℃雜交過夜。洗滌加封閉液，生物素化鼠抗地高辛標(biāo)記消除內(nèi)源性背景，SABC、生物素化過氧化物酶、DAB顯色，脫水透明封片。每個(gè)實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。光學(xué)顯微鏡采集圖片，每張腎組織切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，用Image-Plo Plus 6.0圖像處理軟件，算出平均光密度。

2 結(jié)果

2.1小鼠空腹血糖值及24 h尿蛋白的變化 T1DN組空腹血糖值(21.70±2.26)mmol/L明顯高于對(duì)照組(3.81±0.24)mmol/L(P<0.001)，而聯(lián)合組(11.84±0.69)mmol/L和Insulin組(13.05±0.81)mmol/L的空腹血糖明顯下降(P<0.001)，見圖1A。T1DN組24 h尿蛋白[(286±42.41)μg/24 h]明顯高于對(duì)照組[(32±4.68)μg/24 h](P<0.001)，而聯(lián)合組[(173±17.83)μg/24 h]尿蛋白明顯減少(P<0.001)，Insulin組[(262±34.40)μg/24 h]作用不明顯，見圖1B。

2.2小鼠腎臟病理改變 SR染色觀察腎組織膠原纖維沉積情況，如圖2所示，對(duì)照組腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)完整清晰，基底膜完整，腎小管間質(zhì)未見膠原纖維沉積；T1DN組腎小球肥大增生、腎小管上皮損傷，間質(zhì)膠原纖維的沉積明顯增加(P<0.001)；聯(lián)合組腎小管結(jié)構(gòu)基本完整，腎小管間質(zhì)膠原纖維沉積明顯減少，肥大程度明顯減輕(P<0.001)，而Insulin組的效果不明顯。

2.3小鼠腎組織E-cadherin和FN mRNA與蛋白質(zhì)表達(dá)變化 組織原位雜交結(jié)果顯示(圖3A)，T1DN組腎組織腎小管上皮細(xì)胞E-cadherin mRNA表達(dá)明顯減少(P<0.001)， FN mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.001)，表明T1DN病變時(shí)腎組織腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT；聯(lián)合組E-cadherin mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.001)，F(xiàn)N mRNA表達(dá)明顯減少(P<0.001)；而Insulin組作用不明顯(圖3B、C)。

圖1 小鼠空腹血糖與24 h尿蛋白量Fig.1 Levels of fasting blood glucose and 24-hour urine protein in miceNote: ***.P<0.001.

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示(圖4A)，T1DN組E-cadherin蛋白表達(dá)明顯減少，F(xiàn)N蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.001)；聯(lián)合組E-cadherin蛋白表達(dá)明顯增加，F(xiàn)N蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.001)；Insulin組作用不明顯(圖4B、C)。

2.4小鼠腎組織SOCS2 mRNA與蛋白質(zhì)表達(dá)變化 組織原位雜交結(jié)果顯示(圖5A)，T1DN組SOCS2 mRNA表達(dá)明顯增多(P<0.001)，聯(lián)合組SOCS2 mRNA表達(dá)明顯減少(P<0.001)，Insulin組變化不明顯(圖5B)。

圖2 小鼠腎組織病理變化(SR，×400)Fig.2 Histopathological changes in mice kidneys (SR,×400)Note: ***.P<0.001.

圖3 原位雜交檢測(cè)小鼠腎組織中E-cadherin與FN mRNA的表達(dá)變化(ISH，×400)Fig.3 In situ hybridization detection of E-cadherin and FN mRNA expression levels in mice kidneys (ISH,×400)Note: ***.P<0.001.

圖4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)小鼠腎組織中E-cadherin、FN 蛋白的表達(dá)變化(IHC，×400)Fig.4 Immunohistochemistry detection of E-cadherin and FN protein in mice kidneys (IHC,×400)Note: *.P<0.05,***.P<0.001.

圖5 原位雜交檢測(cè)小鼠腎組織中SOCS2 mRNA的表達(dá)變化(ISH，×400)Fig.5 In situ hybridization detection of SOCS2 mRNA expression levels in mice kidneys (ISH,×400)Note: ***.P<0.001.

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示(圖6A)，T1DN組SOCS2蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.001)。聯(lián)合組SOCS2 蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.001)，Insulin組SOCS2 蛋白表達(dá)稍減少(P<0.01)(圖6B)。

圖6 免疫組織化學(xué)檢測(cè)小鼠腎組織中SOCS2 蛋白的表達(dá)變化(IHC，×400)Fig.6 Immunohistochemistry detection of SOCS2 protein in mice kidneys (IHC,×400)Note: **.P<0.01,***.P<0.001.

圖7 SOCS2表達(dá)量與SR膠原纖維沉積、E-cadherin、FN表達(dá)量間的相關(guān)性Fig.7 Correlations between SOCS2 expression and SR collagen fiber deposition,E-cadherin and FN expression levels

2.5相關(guān)性分析 T1DN小鼠腎組織SOCS2的表達(dá)水平與腎組織膠原纖維沉積量呈正相關(guān)(r=0.959 6,P<0.001，圖7A)，與腎組織E-cadherin表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.719 1,P<0.01，圖7B)，與腎組織纖維連接蛋白FN表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.630 8,P<0.01，圖7C)。

3 討論

據(jù)報(bào)道DN的基本潛在機(jī)制涉及高糖(High-glucose,HG)誘導(dǎo)一系列細(xì)胞內(nèi)事件，包括活性氧生成，促分裂原活化蛋白激酶活化以及轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)等。通過這些不同的細(xì)胞內(nèi)途徑增強(qiáng)促炎因子和促纖維化因子產(chǎn)生，引發(fā)腎損傷和纖維化的修復(fù)過程[7,8]。因此，確定可能導(dǎo)致DN的新治療靶點(diǎn)具有重要臨床意義。

越來越多的證據(jù)表明，SOCS2的異常表達(dá)可能參與了T1D的發(fā)展[9]。Lebrun等[5]在組成型產(chǎn)生SOCS2的轉(zhuǎn)基因小鼠β細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)SOCS2表達(dá)擾亂了胰島素原的成熟，產(chǎn)生的SOCS2不足以誘導(dǎo)糖尿病，但它會(huì)導(dǎo)致葡萄糖耐受不良，SOCS2的增多可能易于導(dǎo)致β細(xì)胞衰竭，表明SOCS2在T1D中發(fā)揮著重要作用。SOCS2作為糖尿病的調(diào)節(jié)因子，敲除SOCS2可以防止鏈脲佐菌素誘導(dǎo)成年雄性小鼠的T1D，可能是通過增加β細(xì)胞對(duì)GH的超敏反應(yīng)，對(duì)胰腺β細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用[10]。另有研究報(bào)道，上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，稱為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化EMT過程，在發(fā)育、傷口愈合的過程中是不可或缺的，并且在病理學(xué)上導(dǎo)致纖維化和癌癥進(jìn)展，也就是說EMT在糖尿病并發(fā)癥DN的腎臟纖維化發(fā)展過程中起著很重要的作用[11-13]。然而，SOCS2在T1DN中對(duì)EMT的作用尚未有報(bào)道。本研究通過STZ成功誘導(dǎo)T1DN小鼠模型，用原位雜交技術(shù)和免疫組化檢測(cè)了腎組織SOCS2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SOCS2在T1DN 組中上調(diào)。為了揭示SOCS2在EMT導(dǎo)致纖維化過程中的作用，本研究又檢測(cè)了纖維化相關(guān)指標(biāo)，首先T1DN組24 h尿蛋白顯著增多，SR染色顯示小球肥大增生、腎小管上皮損傷、結(jié)構(gòu)破壞，間質(zhì)膠原纖維的沉積。此外，E-cadherin表達(dá)減少和FN表達(dá)增加，提示EMT發(fā)生[13,14]。進(jìn)一步Pearson分析，SOCS2與腎組織膠原纖維沉積量和FN呈正相關(guān)，與E-cadherin呈負(fù)相關(guān)，提示SOCS2可能參與了T1DN中的EMT過程。

HG誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞GMCs中的血管緊張素Ⅱ產(chǎn)生，血管緊張素Ⅱ增加血管阻力，減少腎血流量，并刺激GMCs中ECM的產(chǎn)生[15]。近年來，貝那普利作為第3代ACEI類藥物，被廣泛用于腎臟疾病，如腎性高血壓和DN等，已有研究發(fā)現(xiàn)貝那普利可通過減少腎臟膠原的合成和抑制腎內(nèi)的RAS 而減輕腎臟的纖維化[16,17]。因此，本研究另設(shè)了貝那普利聯(lián)合傳統(tǒng)降糖藥胰島素為聯(lián)合組和單獨(dú)胰島素用藥為Insulin組，與T1DN組相比，聯(lián)合組較Insulin組更好地改善了腎臟組織病變并降低了T1DN小鼠的蛋白尿，同時(shí)腎小管間質(zhì)膠原纖維沉積明顯減少，E-cadherin表達(dá)增加和FN表達(dá)減少，SOCS2表達(dá)減少。初步推測(cè)貝那普利聯(lián)合傳統(tǒng)降糖藥胰島素可能通過調(diào)節(jié)SOCS2，一定程度上改善T1DN的纖維化過程，提示SOCS2在T1DN的EMT過程中發(fā)揮著重要作用。

總之，SOCS2參與了STZ誘導(dǎo)的T1DN小鼠腎臟的EMT過程，并發(fā)揮著重要作用。然而，對(duì)于闡明SOCS2在T1DN發(fā)病機(jī)理中的作用，還需要進(jìn)一步的細(xì)胞學(xué)及分子生物學(xué)的研究，從而為T1DN的預(yù)防和治療構(gòu)建理論基礎(chǔ)。