抵抗素通過TLR4/MyD88依賴途徑促進(jìn)牛肺泡巨噬細(xì)胞炎癥因子產(chǎn)生①

岳夢佳 左之才 陽明賢 李 碧 岑 垚 姚彩霞

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，環(huán)境公害與動(dòng)物疾病四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，溫江 611130)

抵抗素(Resistin,RETN)，是一種胰島素的負(fù)調(diào)節(jié)物，通過拮抗肝臟、骨骼肌和脂肪等組織中的胰島素減少機(jī)體對葡萄糖的吸收，在調(diào)節(jié)能量平衡和代謝中具有重要作用[1,2]。但近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)抵抗素還具有強(qiáng)烈促炎作用，更被認(rèn)為是一種促炎細(xì)胞因子[3]。研究表明，抵抗素可由中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞大量分泌表達(dá)[4,5]，另外，抵抗素也可誘導(dǎo)IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎細(xì)胞因子釋放，促使巨噬細(xì)胞由抗炎的M2型向促炎的M1型表達(dá)調(diào)控炎癥過程[6,7]。抵抗素的強(qiáng)烈促炎作用已被廣泛認(rèn)可，且越來越多研究顯示炎癥是一種高水平的抵抗素狀態(tài)[8]，但其潛在的分子機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。

Toll樣受體 (Toll like receptor,TLR) 作為連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁[9,10]，其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其作用一直是科研人員研究的焦點(diǎn)。由髓樣分化因子88 (Myeloid differentiation primary respo-nse protein 88,MyD88) 承接的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑稱為MyD88依賴途徑，其他稱為MyD88非依賴途徑[11]。當(dāng)MyD88分子被激活后，募集下游IL-1受體相關(guān)激酶 (Interleukin-1 receptor associated kinas,IRAK)，經(jīng)過一系列信號(hào)傳導(dǎo)，最后活化核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclearfactor kappa,NF-κB)[12,13]，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α等釋放增加，放大炎癥信號(hào)，誘發(fā)炎癥反應(yīng)。

抵抗素能與TLR4發(fā)生直接相互作用，與TLR4-MD2復(fù)合物結(jié)合，誘發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)，在人單核白血病細(xì)胞(THP-1)上已得到證實(shí)[14]。然而，抵抗素的促炎作用及其細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制尚未完全闡明，且缺少牛肺泡巨噬細(xì)胞的相關(guān)研究。本試驗(yàn)基于抵抗素和TLR4信號(hào)通路在炎癥和生理方面的重要作用，利用牛抵抗素處理牛肺泡巨噬細(xì)胞，檢測TLR4/MyD88依賴途徑信號(hào)通路相關(guān)基因(TLR4、MyD88、IRAK4、NF-κB)mRNA和蛋白表達(dá)量以及下游促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α表達(dá)水平，初步探討抵抗素誘導(dǎo)條件下TLR4/MyD88依賴途徑信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)變化規(guī)律，以期為后續(xù)炎癥疾病的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料 高糖DMEM購自Hyclone公司；胎牛血清購自生工生物有限公司；Premix Taq酶、反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購自TaKaRa公司；牛抵抗素(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院環(huán)境公害與動(dòng)物疾病四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室原核表達(dá)提取，且經(jīng)內(nèi)毒素去除試劑盒除去內(nèi)毒素)；牛肺泡巨噬細(xì)胞采自健康牛新鮮肺部組織；IL-6、IL-1β和TNF-α ELISA檢測試劑盒購自南京建成試劑有限公司；單克隆抗體β-actin (4790；Cst)，TLR4(NBP2-24538SS；Novus)，MyD88(70R-50098；Fitzgerald)，IRAK4(AP23599PU-N；OriGene)，P65(NBP2-24541SS;Novus)；TLR4、MyD88、IRAK4、NF-κB、β-actin的檢測引物見表1，引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2方法

1.2.1牛肺泡巨噬細(xì)胞的采集與分組 方法參照Xu等[15]實(shí)驗(yàn)方法，肺泡巨噬細(xì)胞陽性分離率大于96%。無菌并含有200 U/ml青霉素、200 μg/ml鏈霉素的PBS，經(jīng)4℃預(yù)冷處理，保存?zhèn)溆?。采取眼觀無病變并保留10 cm以上氣管的完整水牛肺部，結(jié)扎氣管。PBS洗凈肺表面，將適量PBS經(jīng)氣管灌入肺部，同時(shí)適當(dāng)輕柔肺部，收集灌洗液，重復(fù)3次。灌洗液經(jīng)200目紗布過濾，1 500 r/min離心10 min，收集細(xì)胞。PBS洗滌細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min。用含胎牛血清100 ml/L的細(xì)胞培養(yǎng)液(胎牛血清與DMEM 按1∶9體積混合)重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，置于37℃、5%CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞6 h。PBS洗去未貼壁細(xì)胞，消化重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/ml，通過臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)算細(xì)胞存活率， 分裝于6孔板中，置于細(xì)胞孵育箱內(nèi)培養(yǎng)3 h。加終濃度為100 ng/ml 的抵抗素進(jìn)行誘導(dǎo)，陰性對照添加等體積PBS，每組設(shè)置3個(gè)平行樣。分別離心收集誘導(dǎo)0、1.5、3、6、12、24 h后的上清液和下層細(xì)胞，上清液用于檢測IL-6、IL-1β和TNF-α 的含量，下層細(xì)胞用于檢測TLR4、MyD88、IRAK4和NF-κB mRNA水平以及蛋白表達(dá)。

表1 各基因熒光定量引物

Tab.1 Primer sequence of genes for Real-time PCR

GeneSequenceAccession No.TLR4F:CCTAGCAAGAGCAGAGAACCAGAAGNM-174198.6R:GTCACTGGTGGCTTCTTCTTCACAGMyD88F:AGAAGAGGTGCCGTCGGATGGXM-005222379.3R:TTGGTGTAGTCACAGACAGTGATGAAGIRAK4F:CTGTGGATGAACACCGTGAACCTCNM-001075998.1R:GACACTGACTGGCAACAGAGTACATAGNF-κBF:GAGATCATCGAGCAGCCCAAXM-002695167.5R:ATAGTGGGGTGGGTCTTGGTβ-actinF:GCCCATCTATGAGGGGTACGAF 191490.1R:TCACGGACGATTTCCGCT

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測牛肺泡巨噬細(xì)胞TLR4、MyD88、IRAK4和NF-κB mRAN表達(dá)水平 采用Trizol法提取培養(yǎng)下層牛肺泡巨噬細(xì)胞總RNA，測定總RNA濃度及純度。參照試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，cDNA保存于-20℃。以cDNA為模板，對TLR4、MyD88、IRAK4、NF-κB 的mRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測。cDNA進(jìn)行10～105的10倍系列稀釋，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系：上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，Premix Taq 6.0 μl，模板 5.0 μl。反應(yīng)條件95℃ 3 min，95℃ 10 s，58℃ 30 s，循環(huán)40次，每個(gè)循環(huán)后檢測熒光強(qiáng)度值。實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果采用2-ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算，用內(nèi)參基因β-actin對各基因表達(dá)水平均一化，2-ΔΔCT法計(jì)算公式：ΔCT=CT目的基因-CT內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCT試驗(yàn)組-ΔCT對照組。

1.2.3Western blot法檢測牛肺泡巨噬細(xì)胞中TLR4、MyD88、IRAK4、NF-κB等的蛋白水平 下層細(xì)胞加裂解液，煮沸5 min，14 000 r/min離心5 min；取離心后的樣本上樣(上樣量為20 μg總蛋白)；電泳程序(S1：90 V，15 min；S2：120 V，至結(jié)束)，蛋白樣品經(jīng)電泳分離后，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上(100 V，90 min)；加50 g/L脫脂牛奶室溫封閉1 h后，與 1∶1 000稀釋的兔抗TLR4 抗體、兔抗MyD88抗體、兔抗IRAK4抗體、兔抗NF-κB抗體、兔抗β-actin抗體，4℃孵育過夜；1×TBST洗膜5 min×3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG (1∶5 000)，室溫孵育1 h；1×TBST洗10 min×3次；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法 (Enhanced chemiluminescent，ECL) 顯色，曝光。

1.2.4ELISA檢測牛肺泡巨噬細(xì)胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α濃度 細(xì)胞上清離心，按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-6、IL-1β和TNF-α促炎細(xì)胞因子濃度。

2 結(jié)果

2.1抵抗素促進(jìn)牛肺泡巨噬細(xì)胞TLR4、MyD88、IRAK4和NF-κB的mRNA表達(dá) 將每個(gè)基因陰性對照的0 h的表達(dá)量設(shè)置為1，對TLR4/MyD88依賴途徑信號(hào)通路相關(guān)基因的Real-time PCR結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在100 ng/ml終濃度抵抗素誘導(dǎo)后，TLR4、MyD88、IRAK4、NF-κB mRNA表達(dá)量均明顯增加，如圖1。在抵抗素誘導(dǎo)后3 h，各基因變化均不顯著，當(dāng)誘導(dǎo)6 h后，各基因表達(dá)量均極顯著升高(P< 0.01)，12 h 表達(dá)量最高。

圖1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測牛肺泡巨噬細(xì)胞TLR4、MyD88、IRAK4 and NF-κB的mRNA表達(dá)水平Fig.1 Genes expression of TLR4,MyD88,IRAK4 and NF-κB in BAMs were tested by qRT-PCRNote: PBS.Represents negative control.**.P<0.01 vs PBS.

圖2 Western blot法檢測牛肺泡巨噬細(xì)胞TLR4、MyD88、IRAK4和NF-κB的蛋白表水平Fig.2 Proteins expression of TLR4,MyD88,IRAK4 and NF-κB in BAMs were analyzed by Western blotNote: PBS.Represents negative control.**.P<0.01 vs PBS.

圖3 ELISA檢測牛肺泡巨噬細(xì)胞后上清液IL-6、IL-1β和TNF-α的濃度Fig.3 Concentration of IL-6，IL-1β and TNF-α in supernatant were measured by ELISANote: PBS.Represents negative control.**.P<0.01 vs PBS.

2.2抵抗素上調(diào)牛肺泡巨噬細(xì)胞TLR4、MyD88、IRAK4和NF-κB蛋白表達(dá) 根據(jù)2.1中基因表達(dá)結(jié)果，采用免疫印跡法檢測100 ng/ml抵抗素誘導(dǎo)12 h后TLR4、MyD88、IRAK4、NF-κB蛋白表達(dá)水平。結(jié)果如圖2所示，與對照組相比，抵抗素可顯著誘導(dǎo)牛肺泡巨噬細(xì)胞上述蛋白表達(dá)(P< 0.01)，與基因檢測結(jié)果相符。

2.3抵抗素增加牛肺泡巨噬細(xì)胞IL-6、IL-1β和TNF-α的釋放 采用ELISA試驗(yàn)對100 ng/ml抵抗素處理后各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清中IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎因子進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖3。抵抗素誘導(dǎo)牛肺泡巨噬細(xì)胞1.5 h后，IL-6、IL-1β和TNF-α濃度極顯著增高 (P< 0.01)，且表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間增加而增加，IL-6、TNF-α在12 h達(dá)到峰值。

3 討論

抵抗素具有促炎效應(yīng)，在炎癥的發(fā)生和進(jìn)程中具有重要調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，抵抗素在許多炎性疾病中扮演著重要角色，參與炎性疾病的發(fā)生和恢復(fù)，在動(dòng)脈粥樣硬化[16]、關(guān)節(jié)炎[17]、全身炎癥反應(yīng)綜合征[18]等炎性疾病過程中，均發(fā)現(xiàn)抵抗素處于高表達(dá)狀態(tài)。此外，抵抗素水平與IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎細(xì)胞因子含量正相關(guān)[19,20]。Gao等[21]通過小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抵抗素通過TLR4/NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)TNF-α、IL-1β等炎性細(xì)胞因子表達(dá)增強(qiáng)冠狀動(dòng)脈炎發(fā)展過程中的炎癥反應(yīng)。Jiang等[22]也發(fā)現(xiàn)，在大鼠胰腺腺泡細(xì)胞中，抵抗素可激活NF-κB刺激促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的產(chǎn)生，加重胰腺炎損傷和風(fēng)險(xiǎn)。在本次研究中，發(fā)現(xiàn)牛肺泡巨噬細(xì)胞經(jīng)抵抗素誘導(dǎo)后，NF-κB的mRNA表達(dá)量于6 h極顯著上調(diào)，Western blot 結(jié)果顯示其蛋白水平在12 h也顯著上調(diào)。通過檢測細(xì)胞上清發(fā)現(xiàn)，在該過程中抵抗素以時(shí)間依賴效應(yīng)促進(jìn)IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎細(xì)胞因子表達(dá)釋放，IL-1β和TNF-α表達(dá)量于12 h 達(dá)到峰值。上述結(jié)果顯示抵抗素可促進(jìn)牛肺泡巨噬細(xì)胞IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎細(xì)胞因子表達(dá)，該過程可能與激活NF-κB有關(guān)。Toll樣受體是一類分布廣泛，表達(dá)于多種細(xì)胞中的天然免疫受體，可非特異性結(jié)合病原相關(guān)分子，啟動(dòng)機(jī)體炎癥反應(yīng)，在免疫防御中起著重要作用[23]。其中，TLR4是最早被發(fā)現(xiàn)，且研究最深[24]，不僅可識(shí)別大多數(shù)病原微生物，并激發(fā)機(jī)體天然免疫系統(tǒng)，在炎性疾病中也起著重要調(diào)控作用[25,26]。研究顯示，TLR4與抵抗素密切相關(guān)，且是抵抗素發(fā)揮促炎效應(yīng)的潛在受體之一[27]。在動(dòng)脈粥樣硬化過程中，抵抗素通過TLR4激活NF-κB誘導(dǎo)IL-6和TNF-α表達(dá)，促進(jìn)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)的炎癥反應(yīng)，加重疾病程度[28,29]。盡管抵抗素可通過TLR4發(fā)揮促炎作用，但其胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑卻鮮有報(bào)道?；诖耍覀冄芯堪l(fā)現(xiàn)牛肺泡巨噬細(xì)胞經(jīng)抵抗素誘導(dǎo)6 h后，TLR4及下游信號(hào)分子MyD88和IRAK4的mRNA水平均極顯著增加，12 h達(dá)到峰值，12 h TLR4、MyD88和IRAK4蛋白表達(dá)量較0 h均極顯著上調(diào)。因此推測，TLR4/MyD88依賴途徑可能是抵抗素發(fā)揮促炎作用的關(guān)鍵胞內(nèi)信號(hào)通路之一。

綜上所述，抵抗素可誘導(dǎo)牛肺泡巨噬細(xì)胞釋放IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎細(xì)胞因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，且此過程可能與TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)途徑有關(guān)，提示該信號(hào)通路可能是抵抗素發(fā)揮促炎作用的重要分子機(jī)制之一。本試驗(yàn)初步探討了抵抗素促進(jìn)牛肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制，以期為肺部炎癥疾病的預(yù)防及治療提供新的方向和靶點(diǎn)。