橙皮素對阿霉素心臟纖維化的保護作用

王 敏 孫祖玥

（沈陽醫(yī)學院，遼寧 沈陽 110000）

阿霉素（doxorubicin，Dox）是一種代表性的蒽環(huán)類抗生素，可用于多種實體瘤和非實體瘤的化學治療，如乳腺癌、肺癌、白血病等。然而阿霉素的多種不良反應，特別是心臟毒性，嚴重限制其臨床應用[1]。研究表明橙皮素具有擴張血管、抑制動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展等心血管保護作用[2]。本實驗初步探討橙皮素對阿霉素誘導的心臟纖維化的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：SPF級雄性C57BL/6小鼠40只，體質(zhì)量（22±2）g，購于遼寧省長生生物有限公司。在沈陽醫(yī)學院動物實驗室飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑：橙皮素（Hesperetin，Hes），阿霉素均購于大連美侖生物有限公司。天狼猩紅染色液試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司。Smad、pSmad抗體購自碧云天生物技術有限公司。

1.3 主要儀器：CM1250型冰凍切片機（德國徠卡）；western blot電泳儀及轉(zhuǎn)膜裝置（美國Bio-BAD）；低溫高速離心機（德國，Eppendorf）；搖擺式混勻器（美國Thermo）

1.4 實驗方法

1.4.1 阿霉素心臟毒性模型的建立方法：依據(jù)參考文獻，采用小鼠腹腔注射阿霉素的方法建立阿霉素心臟毒性模型。操作方法如下：阿霉素組、阿霉素橙皮素組均按阿霉素3 mg/kg腹腔注射，每周1次，連續(xù)12周。觀察小鼠體征變化，檢測小鼠心力衰竭指標，出現(xiàn)心力衰竭樣改變說明心肌受到損害。

1.4.2 動物分組：隨機將40只雄性小鼠隨機分為4組，即對照組、橙皮素組、阿霉素組、阿霉素橙皮素組，每組10只。對照組：按20 mL/kg腹腔注射生理鹽水，每周1次，共12周；按10 mL/kg灌服0.5%羧甲基纖維素溶液，隔天1次，共12周。橙皮素組、阿霉素橙皮素組按30 mg/kg灌服橙皮素懸溶液（橙皮素粉末溶于0.5%羧甲基纖維素溶液中，灌胃前震蕩混勻），隔日1次，共12周。處死小鼠，留取心臟制備組織切片，并制備左心室勻漿液，備檢。

1.4.3 指標檢測：采用天狼猩紅膠原染色測定心臟膠原染色程度，采用western blot測定Smad、pSmad蛋白表達情況，嚴格按照試劑盒說明書的步驟操作。

1.5 統(tǒng)計學方法：天狼猩紅染色圖像、western條帶通過Image-Pro Plus 6.0軟件進行定量分析，用SPSS15.0軟件進行統(tǒng)計，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2 結果

由圖1可見，與對照組比較，阿霉素組左心室纖維化區(qū)域明顯偏大，膠原顯著增大變粗，并且膠原含量明顯增加，血管周圍和間質(zhì)纖維化明顯；而阿霉素橙皮素組與阿霉素組相比，左心室纖維化區(qū)域明顯變小，膠原形態(tài)也較細小，并且膠原含量較低。由圖2可見阿霉素引pSmad表達的顯著增加，而與阿霉素組相比，阿霉素橙皮素組具有較低的Smad蛋白磷酸化水平。

3 討 論

橙皮素主要來源于蕓香科柑橘屬，來源廣泛而且廉價，具有健胃、祛痰、利尿等功效[3]?，F(xiàn)代研究表明其在抗心肌重構、抗心肌缺血、抗氧化等心血管保護作用方面具有較好的效果[2]。我們將橙皮素與化療藥物阿霉素聯(lián)用，期望能夠減輕阿霉素心臟毒性，為阿霉素心臟保護劑提供新的選擇。

心臟纖維化是心臟疾病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，可導致心臟收縮和（或）舒張功能不全，最終發(fā)生心力衰竭[4]。心臟纖維化程度常能反應心力衰竭的發(fā)生發(fā)展情況。致纖維化分子機制包括轉(zhuǎn)化生長因子β、血管緊張素Ⅱ、活性氧自由基、炎性因子等，其中轉(zhuǎn)化生長因子β是目前已知最強致纖維化因素[4-5]。經(jīng)典TGFβ通路包括與膜受體結合、Smad2/3磷酸化、與Smad4形成復合體、細胞核內(nèi)基因表達[6]。本實驗中檢測了經(jīng)典通路中Smad2蛋白的表達及其磷酸化水平。結果表明阿霉素組Smad蛋白磷酸化水平明顯增加（P＜0.05），而橙皮素降低阿霉素誘導Smad蛋白激活。這一結果與天狼猩紅膠原染色[7]結果是相符合的。這就說明橙皮素對阿霉素誘導的心臟纖維化具有一定保護作用，其機制可能與橙皮素抑制Smad蛋白激活有關。

圖1 心臟天狼猩紅染色

圖2 左心室Smad、pSmad蛋白電泳