梅毒螺旋體對(duì)新西蘭兔睪丸的病理損傷及其對(duì)精子產(chǎn)生的影響

胡志祥 鄒丹陽 廖春潔 鄭 昕 倪禮楠 尚夢雅 閆靜敏 周平玉,*

1.安徽醫(yī)科大學(xué)上海皮膚病臨床學(xué)院（上海 200050）；2.上海市皮膚病醫(yī)院

梅毒（Syphilis）是由梅毒螺旋體(TreponemaPallidum,TP)感染引起的在全球范圍內(nèi)廣泛流行的慢性、系統(tǒng)性性傳播疾病[1]。在中國，梅毒已經(jīng)超越淋病成為最常見的性傳播疾病，穩(wěn)居我國傳染病的前三位，數(shù)據(jù)顯示2017年我國有超過47萬人新感染梅毒[2]。

已知梅毒螺旋體可侵犯人體各器官組織引起不同的病理損傷并出現(xiàn)相應(yīng)的臨床表現(xiàn)，而迄今梅毒螺旋體對(duì)人體睪丸的病理損傷及精子影響的研究鮮少有報(bào)道?；谛挛魈m兔的梅毒模型與人類的梅毒感染有很多相似之處[3]，本研究將梅毒螺旋體接種新西蘭兔睪丸，研究梅毒螺旋體感染后不同時(shí)間點(diǎn)睪丸的形態(tài)學(xué)改變、病理損傷及其對(duì)精子的影響，以期初步認(rèn)識(shí)梅毒螺旋體對(duì)男性生殖系統(tǒng)的影響。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

純種新西蘭雄兔購于上海奉賢輝煌養(yǎng)殖場[SCXK（滬）2009-0022]，體質(zhì)量 2.8～3.5 kg，兔齡在 3個(gè)月左右，飼養(yǎng)于不銹鋼干養(yǎng)式兔籠中，飼料（上海仕林生物科技有限公司）及飲水均不含抗生素。

二、菌株

Nichols標(biāo)準(zhǔn)株由美國華盛頓大學(xué)梅毒研究團(tuán)隊(duì)饋贈(zèng)、廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科轉(zhuǎn)贈(zèng)。

三、主要試劑

10%福爾馬林溶液由1份40%甲醛（西隴化工股份有限公司，廣東汕頭）與9份雙蒸水配制而成，梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗(yàn)（TPPA）和甲苯胺紅不加熱反應(yīng)素試驗(yàn)（TRUST）試劑均由上海市榮盛生物藥業(yè)有限公司提供。蘇木素伊紅試劑盒與Warthin-Starry試劑盒分別由上海杰浩生物有限公司和美國abcam公司提供。

四、實(shí)驗(yàn)方法

（一）菌株的接種

將12只新西蘭兔稱量后隨機(jī)分為8只活性菌株接種組和4只滅活菌株接種對(duì)照組。接種前采集所有家兔的外周血進(jìn)行檢測以排除梅毒螺旋體的感染?；钚跃杲臃N組：從-80℃冰箱中取出加有50%甘油的凍存菌株，置于37℃水浴鍋中快速融化解凍菌株。將新西蘭兔麻醉后，用醫(yī)用安爾碘消毒陰囊區(qū)域進(jìn)行雙側(cè)睪丸接種，每側(cè)睪丸注射暗視野顯微鏡下TP計(jì)數(shù)為3×107個(gè)/mL的Nichols株各1mL。滅活菌株接種對(duì)照組：所用接種菌株均經(jīng)過56℃水浴鍋水浴1h，其余條件均和活性菌株接種組相同。將所有接種后的新西蘭兔隨機(jī)分為3d組、7d組、14d組和21d組，保證每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的分組內(nèi)包括2只活性菌株接種的新西蘭兔和1只滅活菌株接種的新西蘭兔。

（二）睪丸形態(tài)學(xué)觀察

接種前和接種后每隔3d觀察、觸診并記錄所有新西蘭兔睪丸形態(tài)學(xué)變化情況，包括大小、硬度、水腫程度、回縮狀況和潰瘍發(fā)生情況。

（三）睪丸組織學(xué)觀察

在接種后的第3天、第7天、第14天和第21天用空氣栓塞法處死對(duì)應(yīng)時(shí)間段分組的新西蘭兔并剝離睪丸組織，用組織剪剪去每側(cè)睪丸的中末端，于10%福爾馬林溶液充分固定后，送至上海市皮膚病醫(yī)院病理科經(jīng)取材、乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋和切片后分別進(jìn)行HE染色和Warthin-Starry鍍銀染色（W-S）。HE染色：石蠟切片經(jīng)常規(guī)烘烤脫蠟水化后進(jìn)行蘇木素染色、藍(lán)化伊紅復(fù)染、脫水、透明、樹脂封片。W-S鍍銀染色：石蠟切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟水化，于螺旋預(yù)備液常溫處理5分鐘后浸泡于已預(yù)熱的0.5%硝酸銀溶液3～5min，將切片置于還原液中浸染1～5min（此過程于65～70℃震蕩水浴鍋內(nèi)進(jìn)行），之后進(jìn)行熱純水沖洗、脫水、透明、樹脂封片。閱片由專業(yè)病理人員在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行。

（四）兔外周血樣本的采集

于處死家兔的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)用真空抗凝管經(jīng)兔耳緣靜脈采血2mL，經(jīng)3000×g離心5min后取上層血清行梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗(yàn)（TPPA）和甲苯胺紅不加熱反應(yīng)素試驗(yàn)（TRUST）檢測。

結(jié) 果

一、不同時(shí)間點(diǎn)兔睪丸的形態(tài)學(xué)變化

活性菌株接種組睪丸形態(tài)學(xué)表現(xiàn)如圖1所示，與接種前相比，接種后第9天兔睪丸開始逐漸腫脹且觸診變硬，于12～15d時(shí)兔睪丸腫脹最為明顯且均不可回縮，部分兔睪丸伴明顯水腫。隨后兔睪丸腫脹程度逐漸減小，且觸診硬度逐漸下降，至第21天兔睪丸恢復(fù)至比接種前稍大且略硬狀態(tài)。本次實(shí)驗(yàn)中所有新西蘭兔均未發(fā)生睪丸潰瘍。滅活菌株接種組僅在接種后第3天出現(xiàn)輕微睪丸腫脹，無明顯變硬。

圖1 活性菌株接種組不同時(shí)間點(diǎn)兔睪丸形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

二、兔血清TPPA和TRUST結(jié)果

活性菌株接種組接種前及接種后的3d組兔血清樣本TPPA及TRUST檢測結(jié)果均為陰性，7d組、14d組和21d組家兔血清的TPPA結(jié)果呈陽性，TRUST滴度呈上升趨勢，其中除外14d組中1號(hào)兔血清TPPA和TRUST結(jié)果均為陰性，表明其梅毒模型建立失敗，將其剔除實(shí)驗(yàn)組。滅活菌株接種組各時(shí)間點(diǎn)采集的兔血清樣本檢測結(jié)果均為陰性。詳見表1。

表1 兔血清TPPA和TRUST結(jié)果

三、接種后不同時(shí)間點(diǎn)的兔睪丸病理表現(xiàn)

根據(jù)已有研究顯示：正常兔睪丸由緊密間隔的生精小管和間質(zhì)區(qū)組成。生精小管由排列整齊的精原細(xì)胞組成，完全成熟的精子通常見于腔內(nèi)。管間間隙或間質(zhì)區(qū)包含小靜脈、小動(dòng)脈和間質(zhì)細(xì)胞，也可見少量分散的淋巴細(xì)胞[4,5]。在活性菌株接種組中：3d組的兔睪丸組織學(xué)特征為出現(xiàn)急性炎癥的顯微區(qū)，主要表現(xiàn)為少量的多形核白細(xì)胞（中性粒細(xì)胞為主）和淋巴細(xì)胞浸潤，尤其在血管周圍 （圖2 A）；7d組的兔睪丸組織切片中間質(zhì)和血管區(qū)出現(xiàn)中度炎癥改變，多形核細(xì)胞較3d組減少，淋巴細(xì)胞的比例明顯增加（圖2 B）；14d組的兔睪丸間質(zhì)和血管區(qū)出現(xiàn)明顯的單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，生精小管出現(xiàn)萎縮，精子產(chǎn)生受到抑制（圖2 C）；21d組的兔睪丸組織切片中出現(xiàn)近乎滿視野的淋巴細(xì)胞浸潤，睪丸間質(zhì)出現(xiàn)纖維化，生精小管萎縮明顯，成熟精子數(shù)量顯著減少（圖2 D）。

作為對(duì)照組，滅活菌株接種組的兔睪丸病理切片組織學(xué)特征除了在3d組中出現(xiàn)了急性炎癥，表現(xiàn)為少量的多形核白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤外，其余時(shí)間點(diǎn)和正常睪丸組織病理表現(xiàn)無明顯差異（圖3）。

圖2 活性菌株接種組接種后不同時(shí)間點(diǎn)的兔睪丸病理表現(xiàn)

圖3 滅活菌株接種組接種后不同時(shí)間點(diǎn)的兔睪丸病理表現(xiàn)

四、接種后不同時(shí)間點(diǎn)的兔睪丸鍍銀染色表現(xiàn)

如圖4所示，活性菌株接種組中3d組兔睪丸鍍銀染色顯示梅毒螺旋體位于生精小管中，7d組及14d組結(jié)果顯示梅毒螺旋體位于間質(zhì)區(qū)，而在21d組的兔睪丸鍍銀染色中未發(fā)現(xiàn)梅毒螺旋體。滅活菌株接種組的兔睪丸鍍銀染色中未發(fā)現(xiàn)梅毒螺旋體存在。

圖4 活性菌株接種組接種后不同時(shí)間點(diǎn)兔睪丸鍍銀染色表現(xiàn)

討 論

梅毒是一種全身性疾病，梅毒的病原體梅毒螺旋體可侵犯人體各個(gè)器官組織，如皮膚黏膜、眼、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)臟器官等。根據(jù)文獻(xiàn)，梅毒睪丸炎、梅毒性睪丸鞘膜積液等病例也被陸續(xù)報(bào)道出來[6,7]，近期一項(xiàng)研究顯示，1名梅毒病人的精液中檢測出了梅毒螺旋體[8],因而梅毒螺旋體對(duì)睪丸的影響引發(fā)關(guān)注，它是否會(huì)通過影響男性生殖系統(tǒng)和精子而導(dǎo)致男性的生育問題，應(yīng)該引起我們足夠的重視。迄今為止，梅毒螺旋體在體外的長期培養(yǎng)依舊是梅毒研究的難點(diǎn)，但其在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的傳代培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟。大量研究表明新西蘭兔是梅毒研究很好的動(dòng)物模型，經(jīng)睪丸接種可對(duì)梅毒螺旋體進(jìn)行傳代擴(kuò)增，而經(jīng)背部皮損接種可以很好的模擬一期梅毒典型的硬下疳皮損[9]。由于新西蘭兔的梅毒模型可模仿人類的梅毒感染的許多臨床癥狀，故此我們選用新西蘭兔建立梅毒模型來研究梅毒螺旋體對(duì)睪丸的病理損傷及其對(duì)精子產(chǎn)生的影響。

Lukehart等的研究顯示新西蘭兔經(jīng)睪丸接種梅毒螺旋體后，在9～11d里睪丸出現(xiàn)明顯臨床癥狀[10]，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果12～15d有所差別。因此不能依據(jù)固定的時(shí)間點(diǎn)作為處死家兔分離梅毒螺旋體菌株的指標(biāo)，必須根據(jù)實(shí)際的睪丸腫脹程度來判定。本實(shí)驗(yàn)還通過對(duì)兔血清進(jìn)行TPPA及TRUST檢測來判定梅毒兔模型是否建立成功，根據(jù)文獻(xiàn)及經(jīng)驗(yàn)，活性菌株接種兔睪丸所建立的梅毒兔模型其梅毒血清試驗(yàn)約在1周內(nèi)可轉(zhuǎn)陽[11,12]，本實(shí)驗(yàn)中活性菌株接種組中3d組中兔梅毒血清試驗(yàn)結(jié)果暫未轉(zhuǎn)陽，其余3組其兔血清TPPA及TRUST結(jié)果均為陽性，故其梅毒兔模型建立成功。其中除外14d組中1號(hào)兔梅毒模型建立失敗，故由此將其剔除實(shí)驗(yàn)組。

早在1980年就有文獻(xiàn)報(bào)道，經(jīng)睪丸接種梅毒兔模型在感染初期其睪丸組織學(xué)特征是單核細(xì)胞浸潤，在感染后的第6天即有淋巴細(xì)胞浸潤，第13天達(dá)到高峰，隨后逐漸出現(xiàn)巨噬細(xì)胞，病灶中浸潤的淋巴細(xì)胞以T細(xì)胞為主[13]，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示的早期睪丸病理表現(xiàn)中以多形核白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤為主有所區(qū)別。但在另一項(xiàng)研究中[14]，分別選取接種后的第3天、第6天、第11天和第24天的兔睪丸病理結(jié)果中其炎癥細(xì)胞浸潤特點(diǎn)與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果無明顯差異。這說明在梅毒感染的早期，即使機(jī)體對(duì)梅毒螺旋體做出快速的免疫應(yīng)答，但隨著梅毒螺旋體的不斷增殖，機(jī)體的炎癥反應(yīng)會(huì)不斷加重，進(jìn)而致使睪丸中生精管不斷萎縮和間質(zhì)纖維化，成熟的精子明顯減少。為了了解梅毒螺旋體在兔睪丸組織內(nèi)的分布情況，我們對(duì)其進(jìn)行了鍍銀染色。我們于活性菌株接種3d組的兔睪丸生精小管中發(fā)現(xiàn)了梅毒螺旋體的存在，而后在7d及14d組的兔睪丸間質(zhì)區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)了梅毒螺旋體，然而21d組兔睪丸中則未有梅毒螺旋體，這也與前面的結(jié)果相對(duì)應(yīng)，在淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤的高峰期后，兔睪丸內(nèi)的梅毒螺旋體被清除，根據(jù)研究顯示淋巴細(xì)胞在遷移到感染部位后釋放淋巴因子吸引并激活巨噬細(xì)胞，被激活的巨噬細(xì)胞可吞噬并殺死梅毒螺旋體[13]。與我們的結(jié)果不同的是，Lukehart等[13]和Lauderdale等[15]僅在兔睪丸間質(zhì)區(qū)中發(fā)現(xiàn)了梅毒螺旋體，而生精小管中未見其分布。但在梅毒病人的精液中也存在梅毒螺旋體這一事實(shí)這也表明我們的結(jié)果是合理的。梅毒螺旋體可侵入兔睪丸間質(zhì)區(qū)和生精小管中，而它可通過黏多糖酶、透明質(zhì)酸酶等機(jī)制對(duì)機(jī)體組織造成損傷[16]，故我們推測梅毒螺旋體所造成的睪丸損傷不僅是因?yàn)槠湔T發(fā)宿主免疫反應(yīng)的產(chǎn)生，也有可能與它本身入侵所造成的組織損傷有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)所建立的梅毒兔模型在其病程發(fā)展中出現(xiàn)了睪丸損傷以及精子數(shù)量減少的表現(xiàn)，我們可以推測梅毒螺旋體可能會(huì)通過造成睪丸組織損傷及精子數(shù)量減少等影響其生育情況，但由于無法從梅毒患者中完成相關(guān)探究，且我們僅選取了接種后3周內(nèi)的兔睪丸進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，且實(shí)驗(yàn)兔數(shù)量存在一定限制，所以針對(duì)男性梅毒患者在感染梅毒螺旋體后是否會(huì)在一定的時(shí)間段內(nèi)因成熟的精子數(shù)量減少而影響到生育能力，需要我們更進(jìn)一步的研究。