細(xì)胞3D打印技術(shù)概述

趙雨

目前，英國有5 000多人在等待移植新的腎臟。在接下來的一年里，經(jīng)過平均大約30個月的等待后，他們中只有不到一半的人會得到新的腎臟。其余的人將繼續(xù)等待，可他們不能永遠(yuǎn)堅持下去： 2016年，457名英國人在等待新腎、新肝、新心臟或新肺的過程中死亡。另有875人由于已經(jīng)病得無法接受移植手術(shù)而從候補名單上被除名。而在中國這種情況更為嚴(yán)重，據(jù)統(tǒng)計，中國的人體器官的供需比僅為1∶30，與英美發(fā)達(dá)國家的1∶3左右的供需比相差甚遠(yuǎn)。在數(shù)以萬計的等待者中，每年僅有幾千名幸運兒可以接受器官移植。

1 生物3D打印技術(shù)簡介

如果科學(xué)家們不再依賴稀缺的捐贈器官，而是能夠在實驗室中快速、廉價地構(gòu)建健康的新器官，并將患者自身的細(xì)胞作為原材料，那會怎樣 在過去的約15年里，這個夢想推動了在生物3D打印領(lǐng)域的投資和研究。生物3D打印技術(shù)是將生物單元（細(xì)胞/蛋白質(zhì)/DNA等）和生物材料按仿生形態(tài)學(xué)， 生物結(jié)構(gòu)或生物體功能， 細(xì)胞特定微環(huán)境等要求用“三維打印”的技術(shù)手段制造出具有個性化的體外三維結(jié)構(gòu)模型或三維生物功能結(jié)構(gòu)體。其科學(xué)研究、技術(shù)應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展廣涵于生物3D打印裝備和生物墨水的研發(fā)及制造、高端醫(yī)療器械的制造、復(fù)雜組織工程支架制造、體外生物功能結(jié)構(gòu)體的制造、生物/病理/藥理模型和新藥檢測模型制造等。

生物3D打印作為一門新興交叉前沿技術(shù)領(lǐng)域，目前在國內(nèi)外得到前所未有的戰(zhàn)略關(guān)注， 如美國增材生物制造探討，歐盟《制造業(yè)的未來：2015～2020戰(zhàn)略報告》、“十三五”規(guī)劃綱要、國家科學(xué)技術(shù)部/工業(yè)和信息化部3D打印戰(zhàn)略規(guī)劃等均將以細(xì)胞和先進(jìn)生物材料為基礎(chǔ)的生物制造和生物3D打印技術(shù)視為國家重要戰(zhàn)略發(fā)展方向。

2 生物3D打印技術(shù)的應(yīng)用

根據(jù)所用生物材料性能的不同，清華大學(xué)生物3D打印中心將目前生物3D打印技術(shù)分為4個層次。

第1層次是打印無生物相容性要求的材料，可應(yīng)用于3D打印體外病例模型、手術(shù)導(dǎo)板、3D打印體外假肢或矯形輔具等領(lǐng)域，該層次的應(yīng)用極大地發(fā)揮了3D打印在個性化定制方面的優(yōu)勢，幫助相關(guān)病人量身定做相關(guān)手術(shù)模型或治療工具，可使病人得到更好的治療。

第2層次是打印具有生物相容性，但非降解材料。此類打印產(chǎn)品可以作為體內(nèi)永久植入物，材料可以是鈦合金等金屬等材料，也可以是高分子等惰性材料等，其中3D打印金屬植入物廠商愛康醫(yī)療已獲得多個CFDA上市許可證書，產(chǎn)品已應(yīng)用于臨床。

第3層次是打印具有良好生物相容性且可降解的生物材料，主要的應(yīng)用領(lǐng)域為打印組織工程支架。其要求打印的體內(nèi)植入物不僅能與體內(nèi)相容，還要具有降解特性，在體內(nèi)一定時間促進(jìn)體內(nèi)缺損組織的生長和愈合。由清華大學(xué)生物制造中心獨創(chuàng)的3D打印低溫沉積制造技術(shù)集成了生物3D打印與冷凍干燥微觀制孔技術(shù)的優(yōu)勢，可實現(xiàn)同時具有宏觀可控孔隙（百微米級）與微觀微絲孔隙（十微米級）的組織工程支架的3D打印，提高了支架內(nèi)的細(xì)胞種植率，更利于細(xì)胞在支架內(nèi)部的生長和組織功能的實現(xiàn)，并在骨組織工程支架等領(lǐng)域應(yīng)用良好，并已開始向臨床轉(zhuǎn)化。

第4層次是打印活性細(xì)胞，蛋白及其他生物活性分子等，該層次的生物3D打印技術(shù)也被稱作細(xì)胞3D打印技術(shù)。細(xì)胞3D打印技術(shù)可以直接將細(xì)胞、蛋白及其他具有生物活性的材料（例如蛋白質(zhì)，DNA，生長因子等）作為3D打印的基本單元，以3D打印的方式，直接構(gòu)建體外生物結(jié)構(gòu)體、組織或器官模型。

3 細(xì)胞3D打印的技術(shù)挑戰(zhàn)

細(xì)胞3D打印技術(shù)是目前生物3D打印技術(shù)的最前沿技術(shù)，也是實現(xiàn)器官打印的最大潛在技術(shù)。打印過程中，細(xì)胞必將承受一定的機械力，甚至造成一定損傷，因此，細(xì)胞3D打印技術(shù)的實現(xiàn)充滿了各種技術(shù)挑戰(zhàn)，細(xì)胞3D打印的技術(shù)挑戰(zhàn)主要包括以下幾個方面。

3.1 材料能否打印

首先要選擇能被生物3D打印機打印的生物材料/生物墨水，雖然不同的打印工藝對生物墨水粘度有不同要求，但總體來講，太低粘度或太高粘度的生物墨水，都很難被打印。因此，細(xì)胞3D打印的第一個挑戰(zhàn)是要找到可以被打印的生物墨水。

3.2 能否構(gòu)建3D結(jié)構(gòu)

并不是所有被打印的生物墨水都可以構(gòu)建3D結(jié)構(gòu)，為了打印出具有高分辨率的3D復(fù)雜細(xì)胞結(jié)構(gòu)體，細(xì)胞打印墨水需滿足通過提高打印墨水的粘度來提高生物墨水的凝膠能力，以維持層層堆積結(jié)構(gòu)體的力學(xué)性能。

3.3 細(xì)胞能否存活

增加細(xì)胞打印墨水的粘度，會導(dǎo)致打印過程中細(xì)胞打印墨水中的細(xì)胞所承受的剪切力增加，從而導(dǎo)致打印后細(xì)胞存活率的下降。因此，控制好打印過程中細(xì)胞打印墨水的粘度（既不能太高也不能太低），尋找細(xì)胞打印墨水的合適粘彈性區(qū)間，是實現(xiàn)良好細(xì)胞三維打?。己玫某尚涡阅芘c生物學(xué)性能）的重要步驟。

3.4 是否具有功能性

剛打印的3D細(xì)胞結(jié)構(gòu)體，只是細(xì)胞和生物材料的3D組合體，并沒有形成組織特征。因此，打印的3D細(xì)胞結(jié)構(gòu)體，必須經(jīng)過適宜的培養(yǎng)條件，才能形成組織功能性。此環(huán)節(jié)需要保證，生物材料的生物相容性，力學(xué)性能和功能性，培養(yǎng)基的充足供應(yīng)和廢物的充分排出等。甚至有些組織需要特定的生物反應(yīng)器，通過流體，力或電的刺激才能達(dá)到其功能性。

綜上所述，細(xì)胞3D打印的各個環(huán)節(jié)充滿了不同甚至具有一定相互矛盾的技術(shù)挑戰(zhàn)，需要多學(xué)科的交叉背景知識和多年的經(jīng)驗積累去解決。

4 細(xì)胞3D打印技術(shù)分類

其根據(jù)其離散細(xì)胞墨水的方法主要可以分為5類（表1）。

4.1 噴墨式細(xì)胞打印技術(shù)

噴墨式細(xì)胞打印是基于普通噴墨打印機的打印原理，利用熱氣泡或壓電的體積變化，擠壓墨盒內(nèi)的細(xì)胞墨水，離散產(chǎn)生含有細(xì)胞的細(xì)胞墨水的微滴并噴射出去[1]。噴墨打印機的噴嘴直徑僅有幾十微米，可以進(jìn)行高精度的細(xì)胞打印，但是也由于其噴嘴直徑比較小，噴墨式細(xì)胞打印難以離散打印高粘度的細(xì)胞墨水，使得此技術(shù)直接打印三維生物學(xué)實體模型較困難；此外，熱氣泡的產(chǎn)生和壓電的變形會對細(xì)胞造成一定損傷，需較好的控制打印工藝參數(shù)。代表性研究機構(gòu)有德州大學(xué)的Boland教授課題組。

4.2 微擠出式細(xì)胞三維打印技術(shù)

微擠出式細(xì)胞三維打印技術(shù)，利用機械力或氣壓等驅(qū)動力，直接通過微噴頭連續(xù)擠出生物材料和細(xì)胞構(gòu)建三維生物學(xué)結(jié)構(gòu)體[2，3]。由于常用的微擠出式細(xì)胞打印機的噴嘴直徑多在百微米級，打印精度一般，但其擠出式的工藝可以打印高粘彈性的生物墨水，易于實現(xiàn)三維生物學(xué)實體的構(gòu)建。此外，此技術(shù)在犧牲精度的同時，使得打印出的每一個離散單元體積變大，間接地提高了打印效率和細(xì)胞存活率。代表的研究機構(gòu)有清華大學(xué)生物制造中心的孫偉教授課題組，美國哈佛大學(xué)的Jennifer Lewis教授課題組。

4.3 激光直寫式細(xì)胞打印技術(shù)

激光直寫式細(xì)胞打印技術(shù)，是指利用光壓力控制細(xì)胞排列成具有高精度的空間結(jié)構(gòu)，其精度可達(dá)單細(xì)胞量級，但提高的精度也導(dǎo)致成形效率下降明顯，該工藝也難以打印粘度較高的生物材料，使得其打印三維生物學(xué)結(jié)構(gòu)體的能力降低[4]。代表的研究機構(gòu)有美國明尼蘇達(dá)大學(xué)的David Odde教授課題組。

4.4 立體光刻細(xì)胞三維打印技術(shù)

立體光刻細(xì)胞三維打印技術(shù)，通過激光或紫外光在空間的掃描運動實現(xiàn)對含有細(xì)胞的光刻膠的立體固化成形，制造出預(yù)設(shè)計的三維生物學(xué)結(jié)構(gòu)[5]。雖然這種技術(shù)具有高度的柔性，但其成型效率卻不如人意。部分開發(fā)者不再利用激光細(xì)小的光斑掃描立體固化成形，而是利用投影機原理，進(jìn)行面投射，每層同時固化成形。該工藝根據(jù)投影機類型主要可以分為液晶投影儀型和數(shù)字微鏡（Digital Micromirror Devices，DMD）投影儀型，兩者的本質(zhì)區(qū)別是液晶投影儀首先將光源分解成3種單色光，再分別通過3個液晶片控制3種單色光的亮度，最終合成所需的光和圖案，而DMD只是利用一個可以反射光源的數(shù)字陣列式微鏡來實現(xiàn)。該種工藝的光敏水凝膠預(yù)先存儲在成形室內(nèi)，會造成材料浪費，以及難以制造多種細(xì)胞的異質(zhì)結(jié)構(gòu)，且光敏水凝膠多具有不同程度的毒性，使得該種工藝的細(xì)胞存活率一般。代表的研究機構(gòu)有美國加州大學(xué)圣地亞哥分校的Chen Shaochen課題組。

4.5 聲波驅(qū)動式細(xì)胞打印技術(shù)

聲波驅(qū)動式細(xì)胞打印技術(shù)是利用聲波的振動產(chǎn)生微滴噴射的方法，其精度最小可達(dá)10μm左右，但該工藝也是微滴噴射的方法，難以噴射高粘度的生物材料，使得打印三維生物學(xué)結(jié)構(gòu)體的能力受到限制[6]。代表的研究機構(gòu)有美國Stanford大學(xué)的Demirci教授課題組。

綜上所述，各種細(xì)胞打印方法各有所長，但對于具有三維復(fù)雜異質(zhì)生物學(xué)結(jié)構(gòu)體來說，微擠出式細(xì)胞三維打印技術(shù)更為合適，其構(gòu)建多細(xì)胞三維模型更容易，效率更高，細(xì)胞存活率高，打印精度（百微米級）也能滿足一般科研使用需求。所以，目前市場上主流的細(xì)胞3D打印機多是基于該技術(shù)實現(xiàn)，代表公司有德國Envision TEC公司、瑞士Regen Hu公司，國內(nèi)的上普博源（北京）生物科技有限公司（SunP Biotech）、捷諾飛生物科技股份有限公司等。

5 細(xì)胞3D打印的生物墨水分類

微擠出式細(xì)胞三維打印的生物墨水有很多種，根據(jù)其溶膠-凝膠固化轉(zhuǎn)變原理可以分為以下幾種方式（表2）。

5.1 溫敏水凝膠生物墨水

溫敏水凝膠生物墨水可以通過環(huán)境溫度的改變實現(xiàn)其溶膠-凝膠方式的轉(zhuǎn)變。凝膠-溶膠轉(zhuǎn)變溫度在0～37℃之間且生物相容性好的水凝膠材料均有能力作為細(xì)胞打印墨水[7]。最具代表性的溫敏水凝膠細(xì)胞打印墨水為明膠。溫敏水凝膠的溶膠到凝膠的轉(zhuǎn)變方式一般為可逆的，且只要材料溫度達(dá)到轉(zhuǎn)變溫度即可轉(zhuǎn)變，無需使用液體交聯(lián)劑，不受交聯(lián)劑滲透深度影響，也不易出現(xiàn)液體交聯(lián)劑導(dǎo)致三維打印離散層層堆積時，層與層之間出現(xiàn)的層間剝離現(xiàn)象，易于構(gòu)建大尺寸的三維細(xì)胞結(jié)構(gòu)體。

5.2 離子交聯(lián)式生物墨水

以海藻酸鈉[8]為代表的水凝膠材料，可以通過與離子溶液相接觸的方式進(jìn)行交聯(lián)固化，實現(xiàn)溶膠-凝膠方式的轉(zhuǎn)變。但是此種離子置換的交聯(lián)方式反應(yīng)很快，難以利用生物墨水與交聯(lián)劑預(yù)混合的方式打印，一般只能利用含離子的液體進(jìn)行浸泡或噴射在生物墨水表面進(jìn)行交聯(lián)。但細(xì)胞三維打印機若使用液體浸泡的方式進(jìn)行交聯(lián)，易出現(xiàn)前文提到的層間剝離現(xiàn)象，不利于打印三維生物學(xué)結(jié)構(gòu)體。

5.3 酶促交聯(lián)式生物墨水

以纖維蛋白原[9]為代表的水凝膠材料，可以通過與生物酶相接觸的方式進(jìn)行交聯(lián)，實現(xiàn)溶膠-凝膠方式的轉(zhuǎn)變。此種酶促交聯(lián)方式一般反應(yīng)較慢，生物酶可以混入液體制成交聯(lián)劑，通過液體浸泡的方式進(jìn)行交聯(lián)，也可以與水凝膠生物墨水預(yù)混合后，待時間孵育交聯(lián)。但溶膠到凝膠轉(zhuǎn)變反應(yīng)慢，也增加了成形難度，不易于直接打印三維結(jié)構(gòu)體。

5.4 紫外光固化

部分合水凝膠材料經(jīng)過合成改性，再加入光引發(fā)劑，使得水凝膠生物墨水具有光敏特性，可以通過紫外光進(jìn)行交聯(lián)固化（例如GelMA[10]等）。光敏水凝膠一般強度高，紫外光的滲透深度比一般液體交聯(lián)劑的滲透深度更深，但光引發(fā)劑的引入，會降低生物墨水的生物活性。

6 細(xì)胞3D打印的未來

盡管目前細(xì)胞3D打印已能打印多種細(xì)胞，甚至可以構(gòu)建一些簡單的組織等，但其距離器官打印還有一段距離，未來值得關(guān)注一下幾方面的研究突破或趨勢變化，以促進(jìn)細(xì)胞3D打印技術(shù)的向前發(fā)展。

6.1 研究新型生物墨水

目前，尚不存在理想型的生物墨水?；谔烊簧锊牧系哪锵嗳菪院?，但大多難以打印或力學(xué)性能不好?；谌斯ず铣筛叻肿硬牧系哪蛴⌒阅芑蛄W(xué)性能較好，但生物活性一般較差，甚至有些材料沒有經(jīng)過FDA認(rèn)證。未來，研發(fā)打印性能和生物學(xué)性能兼優(yōu)的生物墨水將是行業(yè)不可避免的趨勢。

6.2 產(chǎn)業(yè)化促進(jìn)整個領(lǐng)域快速向前

隨著生物3D打印產(chǎn)業(yè)化的不斷成熟，越來越多的廠商開始開發(fā)商業(yè)化的生物3D打印機，生物3D打印機的功能越來越強大，價格越來越低廉。這使得新進(jìn)入這個交叉領(lǐng)域的研究者，尤其是材料學(xué)家，生物學(xué)家，醫(yī)生等非機械電子專業(yè)的研究者，可以無需花精力在自己不擅長的打印機開發(fā)領(lǐng)域，而專注于生物墨水的研發(fā)及組織或器官的構(gòu)建研究。因此，細(xì)胞3D打印機的產(chǎn)業(yè)化正在促進(jìn)這個領(lǐng)域更快的發(fā)展。

6.3 提供細(xì)胞3D打印的專業(yè)化服務(wù)將是未來的趨勢

細(xì)胞3D打印的交叉學(xué)科特性及技術(shù)挑戰(zhàn)，決定了其入門具有一定的門檻。因此，通過與有經(jīng)驗的科研機構(gòu)合作，或?qū)ふ矣薪?jīng)驗的公司進(jìn)行技術(shù)服務(wù)，將是此領(lǐng)域新入門者快速獲取知識并取得科研成果的便捷途徑。據(jù)此預(yù)測，具有高校研究背景的細(xì)胞3D打印的專業(yè)化服務(wù)公司將會越來越多。

7 結(jié)語

近年，細(xì)胞3D打印技術(shù)隨著生物3D打印機和生物墨水的產(chǎn)業(yè)化已走進(jìn)越來越多的實驗室，更多的交叉領(lǐng)域研究者一起投身到這個實現(xiàn)人類器官再造夢想的領(lǐng)域。相信隨著細(xì)胞3D打印領(lǐng)域的不斷蓬勃發(fā)展，實現(xiàn)器官打印的那天也不會太遙遠(yuǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1] SAUNDERS R E，GOUGH J E，DERBY B.Delivery of human fibroblast cells by piezoelectric drop-on-demand inkjet printing[J].Biomaterials，2008，29（2）：193-203.

[2] KHALIL S，NAM J，SUN W.Multi‐nozzle deposition for construction of 3D biopolymer tissue scaffolds[J].Rapid Prototyping Journal，2005，volume 11（1）：9-17.

[3] KOLSKY D B，TRUBY R L，GLADMAN A S，et al.3D Bioprinting of Vascularized， Heterogeneous Cell‐Laden Tissue Constructs[J].Advanced Materials，2014，26（19）：3124-3130.

[4] ODDE D J，RENN M J.Laser- guided direct writing of living cells[J].Biotechnology & Bioengineering，2000，67（3）：312-318.

[5] ITOGA K，KOBAYASHI J，YANMATO M，et al.Maskless liquid-crystal-display projection photolithography for improved design flexibility of cellular micropatterns[J].Biomaterials，2006，27（15）：3005-3009.

[6] YU Fang.Rapid Generation of Multiplexed Cell Cocultures Using Acoustic Droplet Ejection Followed by Aqueous TwoPhase Exclusion Patterning[J].Tissue Engineering Part C Methods，2012，18（9）：647-657.

[7] ZHAO Y，YAO R，OUYANG L，et al.Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro[J].Biofabricati on，2014，6（3）：035001.

[8] LEE K Y，MOONEY D J.Alginate：Properties and biomedical applications[J].Progress in Polymer Science，2012，37（1）：106-126.

[9] MOSESSON M W.Fibrinogen and fibrin structure and functions[J].Journal of Thrombosis & Haemostasis，2005，3（8）：1894-1904.

[10] BILLIET T，GEVAERT E，DE T S，et al.The 3D printing of gelatin methacrylamide cell-laden tissue-engineered constructs with high cell viability[J].BIOMATERIALS， 2014，35（1）：49-62.