除草劑Atrazine對(duì)四膜蟲BF5株種群增長(zhǎng)的影響

張博霏

摘?要：研究了嗜熱四膜蟲BF5株?（Tetrahymena thermophila?BF5）種群在莠去津（Atrazine）脅迫下的整個(gè)變化過程，通過對(duì)不同濃度莠去津處理下的種群密度變化，種群自然增長(zhǎng)差異，以及種群密度變化的時(shí)間差異，對(duì)莠去津的相對(duì)安全濃度尤其是其對(duì)水生原生動(dòng)物四膜蟲的耐受濃度作初步研究。結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)條件下50ppb濃度莠去津已使四膜蟲種群無法進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，100ppb濃度使種群受到嚴(yán)重?cái)_動(dòng)，150ppb以上濃度使種群在48小時(shí)內(nèi)消亡。24小時(shí)半致死濃度為64.75ppb，96小時(shí)半致死濃度為39.10ppb。

關(guān)鍵詞：嗜熱四膜蟲BF5株;莠去津;種群密度

隨著生活水平的提高，人們對(duì)糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物需求日益增長(zhǎng)，在土地自然產(chǎn)力有限，新的高產(chǎn)品種投入產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)尚需時(shí)日的現(xiàn)狀下，增加包括除草劑在內(nèi)的各種農(nóng)業(yè)化學(xué)品的用量和使用頻度，成了目前的主要增產(chǎn)方式。然而，在農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的增產(chǎn)背后，是相當(dāng)沉重的生態(tài)代價(jià)，甚至直接或者間接地威脅到了人類自身的安全和健康。本實(shí)驗(yàn)所選取的研究藥品——莠去津?（Atrazine）?就是一種長(zhǎng)期以來被認(rèn)為是低毒，甚至是對(duì)人類完全安全的除草劑產(chǎn)品，被長(zhǎng)期并且廣泛地施用。其結(jié)果就是這種藥物在環(huán)境中的普遍存在，在土壤、水體和不少農(nóng)產(chǎn)品中均存在一定劑量的檢出。

1 莠去津（Atrazine）及其相關(guān)研究情況

1.1 莠去津介紹

莠去津是繼西瑪津之后1958年由瑞士嘉基公司開發(fā)的三嗪類除草劑，是旱地除草劑主要品種之一，在國(guó)內(nèi)外應(yīng)用比較廣泛。由于莠去津的優(yōu)良性能及價(jià)格優(yōu)勢(shì)，目前世界上很多國(guó)家普遍應(yīng)用，是國(guó)內(nèi)大量生產(chǎn)的除草劑品種之一。隨著我國(guó)除草劑需求量和使用量的增長(zhǎng)，國(guó)內(nèi)莠去津原藥注冊(cè)生產(chǎn)企業(yè)達(dá)到20家以上，年產(chǎn)能超過6萬噸，已經(jīng)成為北方地區(qū)使用量最大的除草劑品種之一。

莠去津其他名稱有阿特拉津、草脫凈、Aatrex，Aktikon，Coyote和Gesaprim等，化學(xué)名稱為2-氯-4-乙胺基-6-異丙胺基-1，3，5-三嗪。其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

莠去津純品為白色粉末，由三聚氰酞氯與等當(dāng)量的乙胺和異丙胺在脫酸劑存在下作用得到。熔點(diǎn)175.80C，相對(duì)密度123，微溶于水，稍溶于有機(jī)溶劑。在中性、微酸性或微堿性介質(zhì)中穩(wěn)定，遇強(qiáng)堿和強(qiáng)酸易分解，土壤中DT?50?100天，水體中代謝時(shí)間與許多因素相關(guān)。另據(jù)USEPA的資料，其在水體中的DT?50?160天左右，溫度較低時(shí)所需時(shí)間更久。

1.2 有關(guān)莠去津毒性情況的研究

2003年4月加州大學(xué)伯克立分校的Tyrone Hayes等人的研究結(jié)果使得人們對(duì)莠去津等除草劑的使用安全性再次產(chǎn)生質(zhì)疑，相對(duì)3ppb的莠去津飲用水殘留標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)中所使用的濃度要相對(duì)安全得多。在對(duì)非洲爪蛙（?Xenopus laevis?）的蝌蚪進(jìn)行了試驗(yàn)時(shí)，他們把處于發(fā)育階段的蝌蚪放到含有不同濃度的莠去津的水溶液中。當(dāng)莠去津的濃度達(dá)到0.1ppb時(shí)，雄性蝌蚪除了長(zhǎng)出睪丸外，還長(zhǎng)出了卵巢。而當(dāng)濃度達(dá)到1ppb時(shí)，雄蛙用來引吭求偶的喉管便無法正常發(fā)育，這注定使它們?cè)诔赡旰鬅o法正常求偶。此外，研究人員把雄蛙置于含25ppb的莠去津水溶液中，它們的睪酮水平迅速下降。據(jù)此研究人員分析認(rèn)為，莠去津可能促使芳香族酶產(chǎn)物大量產(chǎn)生，結(jié)果把雄激素催化成了雌激素，從而使得雄蛙變成了雌蛙或不雄不雌的“陰陽蛙”。也就是說，對(duì)于實(shí)驗(yàn)中所涉及的兩棲類而言，莠去津可以作為一種環(huán)境激素來看待。

1.3 各國(guó)對(duì)莠去津使用及其殘留量的控制標(biāo)準(zhǔn)

鑒于莠去津的潛在的或已部分顯露的生態(tài)損害，在學(xué)界對(duì)莠去津的安全性問題存在一定程度的分歧的情況下，美國(guó)環(huán)保局（USEPA） 于2003年10月31日公布了莠去津臨時(shí)登記決議。加拿大病蟲害防治管理局（PMRA）依據(jù)美國(guó)環(huán)保局的報(bào)告建議削減莠去津的用量并于2004年1月1日起生效。歐盟國(guó)家則在同一時(shí)期或更早時(shí)間限制或完全禁止了莠去津的使用。

相對(duì)其他國(guó)家的控制力度，我國(guó)對(duì)于莠去津的控制顯得較為寬松，根據(jù)中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)（SAC） 2005年10月3日發(fā)布的G/SPS/N/CHN/88中規(guī)定莠去津在蘋果和梨中的最大殘留限量為200ppb，另在G/SPS/N/CHN/87中規(guī)定莠去津在農(nóng)田灌溉水的限量標(biāo)準(zhǔn)為150ppb。但在最新的生活飲用水國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5749-2005中規(guī)定莠去津殘留應(yīng)少于2ppb，甚至少于美國(guó)的3ppb標(biāo)準(zhǔn)，可見我國(guó)已開始關(guān)注其潛在的危害性。

2 四膜蟲介紹（材料與方法）

隸屬于原生動(dòng)物門、寡膜綱、膜口目、四膜科、四膜蟲屬。已知有10余種。體長(zhǎng)40～60微米，成倒卵形或梨形?？谖挥诟姑媲胺秸?，體表被以縱纖毛帶，口后纖毛帶一般為2條。胞肛和2個(gè)伸縮泡孔均位于細(xì)胞后端。無性生殖為橫分裂。有性生殖為接合生殖。合子核分裂分化產(chǎn)生新的大小核，兩細(xì)胞分開、分裂。

世界性分布，主要產(chǎn)自淡水，也有的生活于咸水或溫泉中。四膜蟲能在無菌的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖，長(zhǎng)期以來用它為材料做了大量營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和藥物學(xué)方面的研究，是真核細(xì)胞基因工程研究的理想材料。

2.1 材料

2.1.1 嗜熱四膜蟲BF5株（?Tetrahymena.thermophila?BF5）

嗜熱四膜蟲BF5株（?T.thermophila?BF5）為實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)純化后的四膜蟲品系，廣泛用于各種實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)用四膜蟲經(jīng)實(shí)驗(yàn)選用培養(yǎng)液1周以上培養(yǎng)，并保證其在實(shí)驗(yàn)所選用培養(yǎng)環(huán)境下可正常繁殖后予以使用。

2.1.2 莠去津藥液

本次實(shí)驗(yàn)所選用的原液為50%莠去津溶液，使用雙蒸水稀釋至10mg/L與1mg/L兩種濃度的實(shí)驗(yàn)用液密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 四膜蟲培養(yǎng)液

實(shí)驗(yàn)中可以供選擇的培養(yǎng)液和培養(yǎng)基種類很多。主要有如下幾種：Singer氏培養(yǎng)液、Elliott氏培養(yǎng)液、（月示）胨培養(yǎng)液、沈錫祺等所用的有機(jī)培養(yǎng)液以及實(shí)驗(yàn)用四膜蟲的原培養(yǎng)液配方，另有固體培養(yǎng)基配方3個(gè)。

2.2 方法

2.2.1 相關(guān)儀器設(shè)備

使用的主要儀器設(shè)備如下：

OLYMPUS BH-2型?臺(tái)式光學(xué)顯微鏡

珠江 LRH-250-G型光照培養(yǎng)箱?廣東省醫(yī)療器械廠

FA1004型??電子天平?上海天平儀器廠

YXQ602型?電熱式蒸汽消毒器?山東新華醫(yī)療器械廠

5-50μL、20-200μL、1-5mL移液槍?Therme Electron

200mL三角瓶、10mL及5mL試管、10mL帶蓋培養(yǎng)管、20及100mL量筒、試管架、各容量燒杯、超凈工作臺(tái)、2mL*24目細(xì)胞培養(yǎng)板、100目藻類計(jì)數(shù)板等

2.2.2 培養(yǎng)液的選擇和培養(yǎng)中理化指標(biāo)的控制

本次實(shí)驗(yàn)綜合考慮了手頭可使用的藥品、預(yù)實(shí)驗(yàn)中四膜蟲的生活情況以及培養(yǎng)液的保存情況，最終選用如下培養(yǎng)液作為菌種保存和實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)液。

培養(yǎng)遵循少量——多管獨(dú)立培養(yǎng)，統(tǒng)一時(shí)間轉(zhuǎn)接，正式實(shí)驗(yàn)前，菌種在選定培養(yǎng)液中經(jīng)至少一個(gè)完整的種群增長(zhǎng)過程。培養(yǎng)溫度為26℃±1℃，無光照，PH 7.0左右，每12小時(shí)或更短間隔搖勻一次以保證培養(yǎng)液中溶解氧?？紤]到四膜蟲對(duì)氧的需求及較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間，擴(kuò)增初期采用10mL試管中加2-3mL培養(yǎng)液的少量多管并列培養(yǎng)的方式，這在一定程度上也可避免在初期種群密度較低時(shí)意外混入的雜菌對(duì)培養(yǎng)進(jìn)度的影響。

3 結(jié)果與分析

3.1 關(guān)于種群的觀察數(shù)據(jù)

于27 ℃恒溫培養(yǎng)6小時(shí)后開始觀察計(jì)數(shù)，經(jīng)過約186小時(shí) 16次觀察計(jì)數(shù)之后確認(rèn)實(shí)驗(yàn)組種群完全消失，期間數(shù)據(jù)見附表一。各梯度種群密度變化情況如下圖。由于150ppb以上濃度數(shù)據(jù)量較少，故不單獨(dú)繪圖。

3.2 關(guān)于個(gè)體差異的觀察數(shù)據(jù)

空白組和50ppb組在前期均存在核交換和結(jié)合生殖，空白組更是保持到了穩(wěn)定期之后仍有核交換，其他各組在實(shí)驗(yàn)過程中未發(fā)現(xiàn)有性生殖現(xiàn)象。平均個(gè)體大小在各組中的差別并不明顯，但在同一管內(nèi)的個(gè)體中存在差別，分析為分裂生殖所致。同時(shí)，在較高濃度（≥150ppb）的組中以及在趨于衰退的管中，非規(guī)則形態(tài)的個(gè)體以及行動(dòng)能力低下的個(gè)體明顯增多。

3.3 來自藥物因素的影響分析

其他的實(shí)驗(yàn)證明莠去津?qū)粑顒?dòng)主要是線粒體活性有抑制作用，考慮其為藥品抑制種群的主要因素。

3.4 來自非藥物因素的影響分析

其他因素如溫度PH等，特別是pH值和培養(yǎng)液內(nèi)溶解氧對(duì)四膜蟲種群的影響也是比較明顯的。實(shí)驗(yàn)初期發(fā)現(xiàn)，在pH值在5以下的培養(yǎng)液中種群難以生長(zhǎng)，甚至在短時(shí)間內(nèi)消亡，當(dāng)pH在6.5-7.5的情況下，四膜蟲種群可正常生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，又無法向管中補(bǔ)充氧氣，即使使用容積為10mL的培養(yǎng)管進(jìn)行5mL以下的培養(yǎng)并間隔一定時(shí)間晃動(dòng)，當(dāng)種群密度上升到一點(diǎn)數(shù)量后，可用肉眼觀察到培養(yǎng)液上層接近液面處的密度要大于液體下層，可見其存在一定程度的缺氧。

4 結(jié)論

以上的分析和部分推斷，對(duì)于實(shí)驗(yàn)所用的四膜蟲菌株，50ppb或以下濃度才是安全的，100ppb是實(shí)驗(yàn)所用的四膜蟲菌株的耐受極限，超過該值的莠去津濃度會(huì)導(dǎo)致種群在48小時(shí)左右崩潰。即使莠去津?qū)Πㄈ祟愒趦?nèi)的溫血?jiǎng)游锒拘圆皇窍喈?dāng)大，但是作為一種半衰期如此長(zhǎng)的化學(xué)物質(zhì)，很難不考慮其慢性毒性和其他不被確定或未知的危害性。相對(duì)最新的飲用水標(biāo)準(zhǔn)的2ppb濃度標(biāo)準(zhǔn)，水果（如蘋果、梨）中的200ppb，農(nóng)業(yè)灌溉用水的150ppb，乃至糧食作物（如玉米）中的50ppb標(biāo)準(zhǔn)都不算低，從保證食品安全的角度，以及突破農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易中的技術(shù)壁壘考慮，都有必要作出更嚴(yán)格的限定。

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