Rab蛋白在稻瘟病菌中的作用研究綜述

王秀婷

【摘 ?要】Rab蛋白是一種GTP酶，以單體形式參與細(xì)胞內(nèi)的囊泡運輸、細(xì)胞增殖等過程。由稻瘟病菌引起的稻瘟病遍布于世界各地，能在各個時期侵染禾本科植物，造成糧食減產(chǎn)等問題。近幾年發(fā)現(xiàn)，Rab蛋白在稻瘟病菌致病過程中發(fā)揮著重要作用，關(guān)于Rab蛋白在稻瘟病菌中的功能與作用機制等方面的研究也越來越多。本文主要介紹了Rab蛋白的結(jié)構(gòu)特點和循環(huán)調(diào)節(jié)機制，對近年來在稻瘟病菌中Rab蛋白的相關(guān)研究進展進行了歸納，還對未來的Rab蛋白在稻瘟病菌中的功能、機制的研究方向進行了展望，以期能更深入了解Rab蛋白與稻瘟病菌致病的關(guān)系，緩解稻瘟病毒的發(fā)生率。

【關(guān)鍵詞】Rab蛋白;稻瘟病菌;囊泡運輸

【中圖分類號】S435.111.41 ?????【文獻標(biāo)識碼】A??????【文章編號】1004-7484（2019）07-0317-02

1 引言

Rab蛋白又稱GTP酶，是小G蛋白Ras超家族中的主要成員，幾乎存在于所有真核生物的具膜細(xì)胞器上。細(xì)胞內(nèi)不同定位的Rab蛋白在功能和運輸過程上構(gòu)成了一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，主要參與細(xì)胞內(nèi)的膜轉(zhuǎn)運過程，此外Rab蛋白也在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、激素調(diào)節(jié)等方面起作用^[1]。

由稻瘟病菌引起的稻瘟病遍布世界各地和各個生長時期，是水稻的重要病害之一，能引起水稻的大幅度減產(chǎn)。此外，稻瘟病毒還能侵染玉米、小麥等多種禾本科植物，嚴(yán)重影響了糧食的生產(chǎn)與安全。近年來，有研究者發(fā)現(xiàn)，囊泡運輸途徑可能與稻瘟病菌的致病機制有重要關(guān)系，而囊泡運輸又與Rab蛋白密不可分，因此有研究者從Rab蛋白入手探究稻瘟病菌的致病性，明確不同的Rab蛋白在稻瘟病菌中的功能與作用機制，已取得了一定的進展^[2]。

目前關(guān)于Rab蛋白與稻瘟病菌致病性之間的研究較少，明確Rab蛋白在稻瘟病菌中的功能作用，有助于進一步發(fā)現(xiàn)稻瘟病菌的致病機理，減輕稻瘟病在水稻等禾本科植物中的蔓延。本文將綜述Rab蛋白的結(jié)構(gòu)特點、循環(huán)調(diào)節(jié)機制，以及Rab蛋白在稻瘟病菌中的研究進展，這有助于進一步探究囊泡運輸與稻瘟病菌侵染植物的機制，進而推動減少因稻瘟病而到帶來的糧食減產(chǎn)。

2 Rab蛋白介紹

2.1?結(jié)構(gòu)特點

Rab蛋白分子量僅為20-30KD，由200個左右的氨基酸組成。不同的Rab蛋白的氨基酸序列相似程度較高，約有55%-80%，常將序列相似度大于75%的蛋白質(zhì)歸為同一種蛋白的不同亞型，如Rab6a，，Rab6b和Rab6c就是同一種蛋白的不同亞型，行使的功能并不完全相同^[3]。

對小鼠、酵母、擬南芥等不同真核生物體內(nèi)的Rab蛋白進行X-射線晶體衍射發(fā)現(xiàn)，這些生物體內(nèi)的不同Rab蛋白都具有與小G蛋白相似的結(jié)構(gòu)特點^[4，5]。Rab蛋白的C端和N端靈活可變，不同Rab蛋白的C端和N端序列和長度均不同，但在C末端常以2個半胱氨酸殘基為結(jié)尾，這個特殊結(jié)構(gòu)被證明與膜的結(jié)合有關(guān)^[6]。而且Kent等人^[8]發(fā)現(xiàn)Rab蛋白C端的不同序列和異戊二烯化修飾與Rab蛋白被特異性地定位到相應(yīng)細(xì)胞器上實現(xiàn)特定功能有關(guān)^[8]。Rab蛋白還含高度保守的G結(jié)構(gòu)域，它由6個疏水的β片層，5個親水的α?螺旋和5個連接β片層與α螺旋的多肽環(huán)組成，其中6個β片層形成疏水的核心，并被親水的α?螺旋包圍，再由多肽環(huán)連接這些β片層與α螺旋^[4]。Rab蛋白與GTP、GDP結(jié)合后發(fā)生構(gòu)象改變的區(qū)域（分子開關(guān)區(qū)域），包括開關(guān)I和開關(guān)Ⅱ，都位于多肽環(huán)上，而且GTP、效應(yīng)蛋白等的結(jié)合位點也位于此。因此Rab蛋白的G結(jié)構(gòu)域?qū)ρ芯克墓δ芎蜋C制具有重要意義。

2.2?作用

Rab蛋白在囊泡運輸、葡萄糖轉(zhuǎn)運、植物生長發(fā)育等過程中起著不可忽視的作用。齊慧杰等已對多種Rab蛋白在植物囊泡運輸中的不同作用進行了闡述，分析Rab蛋白參與囊泡運輸?shù)臋C制。Rab蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、質(zhì)膜、液泡等間的運輸、融合、生物合成有關(guān)。由此可見，Rab蛋白在囊泡運輸中發(fā)揮著巨大的作用，而且可能作用機制各有不同。

此外，在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)現(xiàn)了Rab蛋白的身影，而且Rab蛋白還參與根毛和花粉管的頂端生長，與植物的生物和非生物脅迫響應(yīng)有關(guān)，但這些作用都是以囊泡運輸為基礎(chǔ)，進而使Rab蛋白參與到這些功能中，推動行使相關(guān)功能。

不論是葡萄糖轉(zhuǎn)運，還是激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑或是生長發(fā)育，都能發(fā)現(xiàn)Rab蛋白，而這些功能的實現(xiàn)都依賴囊泡運輸。因此，可以說囊泡運輸參與到了生命活動的全過程，而研究Rab蛋白在囊泡運輸中的作用機制也極具研究意義。

3 Rab蛋白囊泡運輸中的循環(huán)機制及相應(yīng)蛋白

3.1?循環(huán)機制

同一個Rab蛋白在細(xì)胞中一直以失活和活化兩種形式交替存在，且一般失活的Rab蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)中，活化的Rab蛋白在細(xì)胞膜上。

Rab蛋白與GDP結(jié)合以失活狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)它被Rab保護蛋白識別結(jié)合后，在RabGGT酶作用下使Rab蛋白的C末端的半胱氨酸發(fā)生不可逆的異戊烯化^{[3，9，10]}。隨后被GDI（GDP解離抑制因子）識別并結(jié)合形成Rab-GDI復(fù)合體，之后被特異性地運輸?shù)教囟ò屑?xì)胞膜。當(dāng)Rab-GDI復(fù)合體被GDF（GDI置換因子）識別后，將GDI從Rab蛋白上置換出來，并催化Rab-GDP蛋白與膜結(jié)合，此時，GEF（鳥苷酸交換因子）識別多肽環(huán)上的分子開關(guān)區(qū)域，促進Rab蛋白釋放GDP與GTP結(jié)合，同時Rab蛋白構(gòu)型改變?；罨腞ab-GTP蛋白與效應(yīng)蛋白相互作用，當(dāng)Rab完成其使命后，GTP被GAP（GTP 酶激活蛋白）催化水解成GDP，Rab-GDP則被釋放回到胞質(zhì)溶膠中，以待新一輪的循環(huán)再利用。此外，一些未被GEF識別的Rab-GDP蛋白會再次被GDI識別轉(zhuǎn)運至細(xì)胞質(zhì)中等待再循環(huán)或被轉(zhuǎn)運至臨近細(xì)胞膜表面^[11，12]。

3.2 與囊泡運輸相關(guān)的Rab蛋白

大多數(shù)真核生物的囊泡運輸過程包括泡囊形成、轉(zhuǎn)運、黏附、錨定及融合，不同的Rab蛋白參與不同階段的囊泡運輸。

胞吐是指經(jīng)胞吞或胞飲攝入的物質(zhì)在胞內(nèi)降解后的殘渣被排除細(xì)胞外。目前發(fā)現(xiàn)的參與胞吐過程的Rab有Rab1、Rab11、Rab8和Rab27。其中Rab1參與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體間的運輸和自噬過程;Rab11則調(diào)控蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體間的循環(huán)轉(zhuǎn)運過程;Rab8調(diào)控囊泡與質(zhì)膜的融合促使囊泡內(nèi)物質(zhì)向胞外分泌;Rab27則被證實與神經(jīng)突觸的物質(zhì)分泌有關(guān)^{[13，14]}。

胞吞作用是將胞外的大分子或顆粒狀物質(zhì)通過質(zhì)膜包裹，再內(nèi)陷形成囊泡的過程，它與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)遞質(zhì)運輸?shù)裙δ芟嚓P(guān)。Rab5蛋白被發(fā)現(xiàn)與稻瘟病菌早期囊泡運輸和內(nèi)涵體融合有關(guān)，因此目前對Rab5在稻瘟病菌中的效應(yīng)蛋白、特性、機制等的研究也較多。此外，Rab7則與晚期囊泡運輸過程有關(guān)，它主要調(diào)控內(nèi)涵體、溶酶體、高爾基體間的運輸。

自噬過程是將自身細(xì)胞內(nèi)的一些蛋白質(zhì)、細(xì)胞器等包被入囊泡內(nèi)，在運輸至溶酶體附近并與其融合，進而降解被包裹的內(nèi)容物。自噬又與囊泡的形成、運輸、粘附、融合的過程相關(guān)^[13]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，Rab5、Rab11、Rab23、Rab32等參與自噬體的形成，Rab7、Rab24等蛋白促進自噬體的成熟，Rab8a則被證實與自噬體的分泌相關(guān)。

綜上發(fā)現(xiàn)，囊泡運輸?shù)牟煌^程需要多種蛋白質(zhì)間相互作用，不同Rab蛋白在不同的發(fā)育階段表達量不同，而且同一種Rab蛋白也可能多條調(diào)節(jié)途徑有關(guān)?？梢酝茰y，即使是同一蛋白的不同亞族在囊泡運輸中的作用機制也會有所不同，進而構(gòu)成囊泡運輸體系，但可以肯定的是Rab蛋白貫穿于囊泡運輸?shù)娜^程，且通過囊泡運輸實現(xiàn)生物體的其他功能。

4 Rab蛋白在稻瘟病菌中的生化特性

4.1?Rab蛋白在稻瘟病菌中的發(fā)現(xiàn)與表達

目前已發(fā)現(xiàn)稻瘟病菌中含11個假定的Rab蛋白，分別是MGG_06962.6、MGG_01179.6、MGG_01185.6、MGG_06241.6、MGG_04143.6、MGG_08144.6、MGG_06135.6、MGG_01079.6和MGG_07191.6^[6]，這些蛋白的結(jié)構(gòu)與Rab蛋白的主要結(jié)構(gòu)相同，都含靈活多變的C端和N端以及高度保守的G結(jié)構(gòu)域。利用生物分析學(xué)的方法與軟件，建立稻瘟病菌Rab蛋白和真菌Rab蛋白的系統(tǒng)進化樹，張冬梅等人認(rèn)為真菌種類的分化遲于Rab蛋白的分化^[6]。

利用熒光定量PCR、生物信息學(xué)等方法對稻瘟病菌的四個生長發(fā)育階段——菌絲、孢子、芽管、附著孢進行研究分析發(fā)現(xiàn)，不同的Rab蛋白在稻瘟病菌的不同發(fā)育階段的相對表達量呈現(xiàn)各自的特點^[13]，同一種Rab蛋白在不同組織和不同階段的表達量也有明顯的差異，如MoRab1在稻瘟病菌的各個發(fā)育階段均有表達，但呈現(xiàn)明顯差異，在孢子時期表達最多，而MoRab8在芽管發(fā)育階段表達量最高，在附著孢時期最低。

此外，研究者通過對稻瘟病菌中的一些Rab蛋白進行基因敲除得到相應(yīng)突變體以研究Rab蛋白與稻瘟病菌生長之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MoRab51敲除突變體與野生型相比，菌絲生長速度和產(chǎn)孢能力顯著下降，不能萌發(fā)分生孢子和形成附著孢，不僅如此，將MoRab51敲除突變導(dǎo)入水稻離體葉片中發(fā)現(xiàn)該水稻葉片未得稻瘟病，生長良好，進一步觀察發(fā)現(xiàn)，MoRab51敲除突變菌株內(nèi)，囊泡數(shù)量明顯較多且小，這說明了MoRab51在調(diào)控稻瘟病菌的致病過程中起著不可忽視的作用。因此推測稻瘟病菌的致病性與Rab蛋白的囊泡運輸功能密切相關(guān)，若控制Rab蛋白的囊泡運輸功能可能有助于控制稻瘟病毒在禾本科植物中的侵染^[15]。

4.2?Rab蛋白與其他蛋白的相互作用

蛋白質(zhì)之間的相互作用存在于生命活動的全程中，構(gòu)成了細(xì)胞生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中的一個主要組成部分，與信號調(diào)控、轉(zhuǎn)導(dǎo)等有關(guān)。因此，研究蛋白質(zhì)間的相互作用一直都是研究重點、熱點，目前研究蛋白質(zhì)間相互作用的高通量分析法主要有酵母雙雜交系統(tǒng)、表面等離子共振技術(shù)等。找到Rab蛋白的互作蛋白，有便于進一步研究確定效應(yīng)蛋白，進而分析Rab蛋白與效應(yīng)蛋白的互作機制。

林維杰在2011年通過實驗探究了與MoRab5蛋白的互作蛋白，并取得了一定進展。他采用pull?down、酵母雙雜交等技術(shù)來尋找并篩選MoRab5的互作蛋白，找到了約40個互作蛋白，如由MGG_07752編碼的蛋白等，這些互作蛋白有的與囊泡組成有關(guān)，有的與mRNA的轉(zhuǎn)錄、延伸有關(guān)，它們都有一個共同特征，即均參與調(diào)控細(xì)胞的各種生命活動。因此，若進一步分析互作機制，有助于揭示Rab蛋白如何調(diào)控囊泡運輸介導(dǎo)稻瘟病菌的致病性。

齊堯堯等以Rab5的同源蛋白MoRab5s為研究對象發(fā)現(xiàn)，兩個亞型MoRab5A和MoRab5B在稻瘟病菌中的功能有所不同^[13]?；罨癄顟B(tài)下的MoRab5B靶定于早期內(nèi)涵體上，促進早期內(nèi)涵體的融合并以內(nèi)吞作用進入內(nèi)涵體;而活化狀態(tài)下的MoRab5A雖然也能靶定于早期內(nèi)涵體上，但經(jīng)pull-down等方法發(fā)現(xiàn)它并不能促進早期內(nèi)涵體的融合，還發(fā)現(xiàn)Rab5的效應(yīng)蛋白Rabaptin-5也能與MoRab5A和MoRab5B相互作用。此外，若對MoRab5A和MoRab5B分別進行基因敲除得到突變體，然后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)出現(xiàn)MoRab5A的敲除突變體可能有致死性的影響，而MoRab5B的敲除突變體的結(jié)果則與上述MoRab51的敲除突變體相似，都是囊泡數(shù)增加且變小，感染水稻未出現(xiàn)稻瘟病。這些研究都明顯揭示了Rab蛋白的誘導(dǎo)在稻瘟病菌的致病過程中的重要地位。

在植物、酵母菌等動物中的已被發(fā)現(xiàn)并證實多種Rab蛋白的效應(yīng)因子及其相互作用，如Rab7的效應(yīng)蛋白有RILP、ORP1L等，分別調(diào)控囊泡運輸?shù)牟煌^程。關(guān)于稻瘟病菌中Rab蛋白的效應(yīng)蛋白的研究較少，有研究者采用PCR、酵母雙雜交技術(shù)等手段篩選與MoYpt7（稻瘟病菌中的Rab蛋白）的互作蛋白，得到不同基因編碼的約10種互作蛋白，如由MGG_06562編碼的泛素連接酶、MGG_06742編碼的TFIID等，但未具體研究它們之間的互作和效應(yīng)機制。

5 總結(jié)與展望

近年來的研究充分證明囊泡運輸在稻瘟病菌侵染植物的過程中起著不可忽視的作用。目前已對Rab的結(jié)構(gòu)和循環(huán)機制已有一定的認(rèn)識，為進一步研究稻瘟病毒的致病機制與Rab蛋白的關(guān)系奠定了堅實的基礎(chǔ)。運用生物信息分析等方法找到了約11種Rab蛋白在稻瘟病菌中，并通過繪制進化樹推測哺乳動物的Rab蛋白是從真菌中進化而來的，如哺乳動物中的Rab5是由稻瘟病菌的MoRab5B蛋白進化而來的。不同的Rab蛋白在囊泡運輸中的功能各有不同，即使同一種蛋白的不同亞型也有所不同，而且大部分Rab蛋白在稻瘟病菌中的不同階段和時期的表達量不同。此外篩選Rab蛋白的效應(yīng)蛋白，并通過敲除基因等方法研究發(fā)現(xiàn)稻瘟病菌中的一些Rab蛋白與它的致病性密切相關(guān)，一些敲除基因突變體甚至能使稻瘟病菌喪失致病性，如MoRab51敲除突變體等。

然而目前對Rab蛋白與效應(yīng)蛋白間的作用如何調(diào)控囊泡運輸過程的機制研究較少，尚未明確具體作用機制，若能結(jié)合前人的研究結(jié)果，在已知某一特定蛋白的效應(yīng)蛋白的基礎(chǔ)上，進一步分析研究它們之間的協(xié)同過程，明確調(diào)控機制，有助于進一步了解稻瘟病毒的致病機理，為控制稻瘟病毒在水稻等禾本科植物中的侵染提供一定的理論基礎(chǔ)，此外也會推動進一步研究Rab蛋白在囊泡運輸中的機制。

參考文獻

[1]齊慧杰，秦曉惠，劉凌云.植物Rab蛋白家族的研究進展[J].生物技術(shù)通報，2016，32（06）： 7-12.

[2]Atkinson HA. Live-cell imaging of endocytosis during conidial germination in the rice blast fungus， Magnaporthe grisea. Fungal Genet Biol. 2002， 37： 233-244.

[3]楊永敏，郭建，李玉宏，黃曉瑋.Rab蛋白在囊泡轉(zhuǎn)運中的作用及影響[J].中國科學(xué)：生命科學(xué)，2019，49（07）：788-797.

[4]王芳，劉超.植物Rab蛋白的分類與功能[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2014，30（08）：752-760.

[5]Chattopadhyay D，Langsley G，Carson M，et al.Structure of the nucleotide-binding domain of Plasmodium falciparum rab6 in the GDP-bound form[J].Acta Crystallogr D Biol Crystallogr，2000， 56（ Pt 8）：937-944.

[6]張冬梅，方坤海，石振華，王愛榮，魯國東，王宗華.稻瘟病菌Rab族蛋白的結(jié)構(gòu)及演化分析[J].熱帶作物學(xué)報，2009，30（02）：198-204.

[7]Kent L.Rossman，Channing J. Der，Krister Wennerberg.The Ras superfamily at a glance[J].Journal of Cell Science，2005，118（5）：843-845.

[8]Casey P.J， Seabra M.C. Protein prenyltransferases[J].J Biol Chem，1996，271（ 10）：5289- 5292.

[9]Müller M.P， Goody R.S. Molecular control of Rab activity by GEFs，GAPs and GDI.Small GTPases，2018，9：5–21.

[10]Goody R.S， Rak A， Alexandrov K. The structural and mechanistic basis for recycling of Rab proteins between membrane compartments. CMLS Cell Mol Life Sci， 2005， 62： 1657–1670.

[11]尹洪金，錢桂生，王關(guān)嵩.Rab蛋白研究進展[J].免疫學(xué)雜志，2012，28（07）：633-636+ 641.

[12]柴琳琳，萬瑛，吳玉章，等. Rab4蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位及其活性改變對DC內(nèi)源抗原遞呈的影響[J]. 免疫學(xué)雜志，2012，（10）.

[13]齊堯堯. 稻瘟病菌Rab蛋白的定位與生化功能分析[D].福建農(nóng)林大學(xué)，2015.

[14]Rapak A，Seabra MC，Hume AN，et al.Rab27a regulates the peripheral distribution of melanosomes in melanocytes[J].The Journal of Cell Biology，2001，152（4）：795-808.

[15]張冬梅. 稻瘟病菌Rab蛋白功能研究[D].福建農(nóng)林大學(xué)，2009.