無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)的臨床應(yīng)用研究進(jìn)展

陳詠梅 王青云

【摘 ?要】染色體及基因異常是導(dǎo)致不孕不育、流產(chǎn)、早產(chǎn)、新生兒畸形的重要因素，其中以非整倍體染色體異常最為常見(jiàn)，例如21號(hào)染色體，18號(hào)染色體及13號(hào)染色體三體。核型分析及基因檢測(cè)是染色體疾病及基因病的診斷金標(biāo)準(zhǔn)，而羊膜腔取材為有創(chuàng)操作，風(fēng)險(xiǎn)大，周期長(zhǎng)。母體外周血中胎兒游離DNA的發(fā)現(xiàn)使產(chǎn)前非侵入性診斷胎兒染色體疾病成為可能，近年來(lái)利用無(wú)創(chuàng)DNA非侵入性產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)篩查染色體疾病有了很大的發(fā)展，極高的靈敏度以及檢測(cè)成本的降低逐漸使無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)技術(shù)成為孕期胎兒染色體疾病篩查的首選方法。本文重點(diǎn)綜述無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)的臨床應(yīng)用研究進(jìn)展。

【關(guān)鍵詞】產(chǎn)前檢測(cè);無(wú)創(chuàng)DNA;胎兒

【中圖分類(lèi)號(hào)】R198??????【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A??????【文章編號(hào)】1004-7484（2019）07-0139-02

【Abstract】Abnormal chromosome and gene could cause infertility， miscarriage， premature pregnancy， birth defects， and the chromosome aneuploidy abnormality is the most common， such as chromosome 21， 18 ，13 three body. Karyotype analysis and genetic testing are the diagnostic criteria for chromosomal diseases and genetic diseases， while the amniotic cavity is based on invasive operation， with a large risk and long cycle. The discovery of Cell-free fetal DNA in maternal peripheral blood made prenatal non-invasive diagnosis of fetal chromosomal disease possible.In recent years， the use of noninvasive DNA， a non-invasive prenatal detection technology， screening chromosome diseases has made great progress， high sensitivity and reduction of detection cost gradually make noninvasive DNA detection technology become the preferred method of fetal chromosomal disease screening pregnancy. This paper focuses on the progress of clinical application of noninvasive DNA prenatal testing techniques.

【Key words】Prenatal testing; Noninvasive DNA; Fetus

染色體及基因疾病是新生兒死亡及病殘的重要原因，這類(lèi)患兒的出生給家庭及社會(huì)帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)。絕大多數(shù)染色體及基因疾病無(wú)徹底根治的方法，只能通過(guò)孕期產(chǎn)前篩查及診斷避免這類(lèi)患兒的出生。目前針對(duì)胎兒染色體及基因疾病的篩查方法包括血清學(xué)指標(biāo)、侵入性產(chǎn)前診斷、無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)，其中血清學(xué)指標(biāo)的檢出率較低，侵入性產(chǎn)前診斷雖被認(rèn)為是產(chǎn)前診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其操作復(fù)雜，流產(chǎn)及感染的風(fēng)險(xiǎn)較大。目前，采用無(wú)創(chuàng)DNA技術(shù)進(jìn)行非整倍體染色體疾病的篩查檢出率高，對(duì)其他基因疾病篩查技術(shù)逐漸提高，具有操作方便、風(fēng)險(xiǎn)低的優(yōu)點(diǎn)被大力推廣。

1 無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)依據(jù)

我國(guó)的盧煜明教授譽(yù)為“無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)”第一人，早在二十年前就在孕婦外周血中發(fā)現(xiàn)了胎兒的游離DNA，但由于當(dāng)時(shí)受到實(shí)驗(yàn)條件及檢測(cè)技術(shù)的限制，在大量母親游離DNA的背景下，要明確胎兒游離DNA的堿基序列十分困難且耗時(shí)較長(zhǎng)，成本較高^[1]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，基因組測(cè)序技術(shù)更加敏感，可以同時(shí)量化千萬(wàn)數(shù)量的游離DNA片段，準(zhǔn)確分析及度量孕母外周血中的胎兒DNA。在孕12周后，抽取母體足量的靜脈血，利用新一代DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)母體外周血漿中的游離DNA片段進(jìn)行測(cè)序分析，可獲得胎兒基因信息，從而排查胎兒染色體疾病，胎兒游離DNA存在于孕婦外周血中是該項(xiàng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)的現(xiàn)實(shí)依據(jù)^[2]。有研究報(bào)道，孕婦外周血中胎兒游離DNA含量約為全部游離DNA含量的3%-13%，甚至更高，主要來(lái)源于胎盤(pán)，胎兒出生后極短時(shí)間內(nèi)即被清除^[3]。胎兒染色體的異常會(huì)對(duì)孕母外周血中DNA含量帶來(lái)影響，靈敏度極高的基因探測(cè)及分析技術(shù)可發(fā)現(xiàn)其中的微小變化，為該技術(shù)的實(shí)現(xiàn)提供理論依據(jù)。

2 無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)的臨床應(yīng)用

2.1單倍體染色體疾病的篩查

2011年無(wú)創(chuàng)DNA技術(shù)首次應(yīng)用于臨床產(chǎn)前檢測(cè)，并且很快受到各國(guó)醫(yī)療行業(yè)的追捧。有研究表明無(wú)創(chuàng)DNA技術(shù)可排查99%的唐氏綜合征，且假陽(yáng)性率低于0.1%，絲毫不遜于傳統(tǒng)的有創(chuàng)羊膜腔穿刺羊水胎兒細(xì)胞培養(yǎng)的準(zhǔn)確性，且大大降低了對(duì)母體健康及胎兒安全的影響，將檢測(cè)周期由原先的2周縮短到1-2天^[4、5]。專(zhuān)業(yè)人士一致認(rèn)為無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)對(duì)胎兒非整倍體疾病的篩查大有益處，應(yīng)積極推廣，將無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)技術(shù)作為孕10周后產(chǎn)前檢測(cè)的首選方法^[6]。

2.2單基因疾病

無(wú)創(chuàng)DNA技術(shù)在篩查胎兒染色體非整倍體疾病外，進(jìn)一步發(fā)展為對(duì)單基因疾病的篩查^[7]。目前所知，人類(lèi)23個(gè)染色體上分布有約3萬(wàn)余基因，每個(gè)基因約包含27000個(gè)堿基。單個(gè)基因突變導(dǎo)致的基因信息改變從而致病，稱(chēng)為單基因病。迄今已明確的單基因病有近五千種，涉及基因三千余，其中一部分發(fā)病率高，危害性大的常見(jiàn)單基因病已能進(jìn)行臨床基因診斷，如遺傳性耳聾、地中海貧血等^[8、9]。

在無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)染色體非整倍體疾病日漸成熟的今天，科學(xué)家在努力實(shí)現(xiàn)單基因病的檢測(cè)，該項(xiàng)技術(shù)最大的障礙是在母體外周血中得到足量的胎兒遺傳物質(zhì)。前文已述，在母體外周血中胎兒游離核酸以及有核紅細(xì)胞含量極低，必須通過(guò)特定的方法將其從母血中準(zhǔn)確的識(shí)別、分離和鑒定出來(lái)，才能對(duì)其所含基因進(jìn)行準(zhǔn)確分析。目前，國(guó)際上多通過(guò)采集孕婦抗凝外周血后再離心兩次得到血漿成分，最后再手工過(guò)柱法商品化試劑盒提取血漿^[10、11]。目前有效的分離純化方法還十分有限，在一定程度上限制了臨床使用。

2.3父源性遺傳疾病的篩查

目前，使用游離胎兒DNA篩查單基因遺傳病的研究已經(jīng)從性別篩查逐漸過(guò)渡到直接檢測(cè)胎兒所攜主要致病基因是否以父源性為主。這類(lèi)疾病不受母親遺傳物質(zhì)的影響，遵從父系常染色體顯性遺傳規(guī)律，一旦在母親外周血中發(fā)現(xiàn)這類(lèi)基因，即可證實(shí)來(lái)自于胎兒，而非母體本身^[12]。分析父系遺傳的等位基因還可以獲得其他臨床相關(guān)信息，包括分析Y染色體基因序列的出現(xiàn)或缺失得知患兒性別（特異性與靈敏性可達(dá)到100%），鑒別胎兒性別還有利于常染色體隱性疾病的篩查，例如先天性腎上腺增生等，減少了對(duì)男性胎兒進(jìn)行不必要的地塞米松治療^{[13、14]}。對(duì)于常染色體顯性遺傳病，可以直接診斷胎兒是否攜帶突變基因，即是否有患病的風(fēng)險(xiǎn)。而對(duì)于常染色體隱性遺傳病，主要是檢測(cè)胎兒是否遺傳了父源性的致病基因，這樣可使部分孕婦免受有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的痛苦。目前應(yīng)用無(wú)創(chuàng)DNA作為首選篩查手段的此類(lèi)疾病包括β-地中海貧血、纖維樣囊性變、先天性腎上腺皮質(zhì)增生^[15-18]。獲取血漿成分之后，學(xué)者多通過(guò)檢測(cè)孕婦血漿中的男性胎兒特異性基因序列（SRY， DYS14， ZFXY等）來(lái)確定提取的血漿中是否含有胎兒成分。但是這一技術(shù)的缺陷在于選擇基因作為母血漿中胎兒游離的檢測(cè)標(biāo)記存在性別依賴(lài)性，因?yàn)殛幮越Y(jié)果既可能是由妊娠女胎造成也有可能是由提取失敗造成，因而無(wú)法對(duì)檢測(cè)出的陰性結(jié)果進(jìn)行明確的判斷;診斷結(jié)果缺乏父系基因的陽(yáng)性對(duì)照，若進(jìn)一步檢查父親的基因，則可證實(shí)母親血漿中的這類(lèi)基因來(lái)源于胎兒。

2.4母源性遺傳疾病的篩查

這類(lèi)基因在胎兒與母體之間具有一致性，在強(qiáng)大的母親基因背景下，評(píng)估母體血漿中胎兒這類(lèi)突變基因的情況更為困難，研究者對(duì)這類(lèi)基因的檢測(cè)建立了更為復(fù)雜的策略。隨著科技的進(jìn)步，這類(lèi)策略得以實(shí)現(xiàn)，例如大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)，數(shù)據(jù)化聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)等使外周血中DNA的含量的測(cè)量更為敏感且精確，使遺傳自母親的等位基因變異疾病的篩查成為現(xiàn)實(shí)。

目前最為常用且有效的基因篩查技術(shù)為相對(duì)突變劑量（relative mutation dosage，RMD）分析以及相對(duì)單倍型劑量（relative haplotype dosage，RHDO）分析^[19]。RMD可以確定母體血漿中突變的相對(duì)量和致病基因的野生型等位基因。這種方法需要針對(duì)每個(gè)突變?cè)O(shè)計(jì)特異性檢測(cè)，然后推測(cè)出胎兒是否受影響^[20]。該方法較PCR技術(shù)更為便宜，但需要胎兒DNA比例相對(duì)較大，對(duì)部分突變檢測(cè)效果有限。例如，在先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥中發(fā)生突變的21-羥化酶基因具有高度同源的假基因，因此很難針對(duì)高度片段化的母體血漿DNA進(jìn)行檢測(cè)。此外，定制檢測(cè)有時(shí)需時(shí)較長(zhǎng)，應(yīng)用受限。RHDO不依賴(lài)于特異性突變的檢測(cè)，可對(duì)整個(gè)胎兒基因組進(jìn)行基因分型，并與父母雙方的單倍體型進(jìn)行比較^[21]。RHDO可同時(shí)分析多個(gè)基因位點(diǎn)的突變條件，不要求反應(yīng)條件最優(yōu)化（PCR化驗(yàn)對(duì)此要求非常嚴(yán)格），更為敏感。

3 無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)的局限性

胎兒DNA碎片是無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)結(jié)果分析的最重要的穩(wěn)定性參數(shù)，因此母親外周血漿中胎兒游離DNA碎片含量過(guò)低是無(wú)創(chuàng)DNA結(jié)果無(wú)意義的最重要原因^[22]。胎兒游離DNA含量受胎兒染色體狀態(tài)、母親子癇前期及是否吸煙等有關(guān)，受孕早期篩查參數(shù)的影響^[23]。母親體重是影響胎兒DNA碎片的最重要因素，有研究表明肥胖的孕婦無(wú)創(chuàng)DNA檢查失敗及假陰性率明顯上升，其他的生物學(xué)因素，包括植入胎盤(pán)、多胎流產(chǎn)、母親基因型異常、母親患惡性腫瘤等也對(duì)無(wú)創(chuàng)DNA結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生不利影響^[24、25]。

盡管無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)的巨大優(yōu)勢(shì)是毋庸置疑的，但是應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)的核心問(wèn)題在于明確它潛在的局限性。由于胎盤(pán)嵌合體的存在，導(dǎo)致胎盤(pán)的游離核酸與胎兒本身的核型并非總是一致，導(dǎo)致可能出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，因此，針對(duì)胎兒游離核酸的檢測(cè)技術(shù)只能作為篩查手段不能代替診斷。對(duì)每位都要接受產(chǎn)前檢查的孕婦，必須告知她們無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)不能取代傳統(tǒng)常規(guī)產(chǎn)前檢測(cè)。每一個(gè)無(wú)創(chuàng)DNA的陽(yáng)性結(jié)果在作出最終結(jié)論前均應(yīng)被傳統(tǒng)有創(chuàng)產(chǎn)前檢查結(jié)果論證，同樣的，其陰性結(jié)果也不影響自然妊娠的其他產(chǎn)前檢測(cè)。

4 展望

較傳統(tǒng)的產(chǎn)前檢查項(xiàng)目無(wú)創(chuàng)DNA技術(shù)可減低產(chǎn)前檢查的成本，將無(wú)創(chuàng)DNA作為所有懷孕婦女的篩查胎兒染色體非整倍體疾病的首選檢查是目前較為可行的方法之一，或者在傳統(tǒng)產(chǎn)前檢查結(jié)果的基礎(chǔ)上將無(wú)創(chuàng)DNA作為進(jìn)一步篩查胎兒非整倍體疾病的手段。除了篩查13三倍體，18三倍體，21三倍體這類(lèi)常見(jiàn)的胎兒染色體異常外，同樣適用于篩查性染色體異常等疾病，還能篩查多胎妊娠的胎兒染色體異常，可以探測(cè)基因突變（具體適應(yīng)癥仍在探索中）。且隨著各種分子技術(shù)的發(fā)展，單基因疾病的無(wú)創(chuàng)DNA技術(shù)日益成熟，RMD、RDHO分析技術(shù)是檢測(cè)母親遺傳突變或父母親共同遺傳突變的強(qiáng)有力的工具。此外，隨著測(cè)序費(fèi)用的減少，靶基因序列檢測(cè)聯(lián)合RDHO分析技術(shù)將成為單基因疾病無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)的首選。并且學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在孕早期的母血中存在微量的胎兒有核紅細(xì)胞，因其單核、含有完整胎兒遺傳信息且細(xì)胞周期短，被認(rèn)為是實(shí)施無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)較理想的靶點(diǎn)。

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