RT-PCR和熒光探針PCR對(duì)手足口病腸道病毒的檢測(cè)效果分析

何鋒 劉穎迪 程艷君

【摘 ?要】目的：探討RT-PCR和熒光探針PCR對(duì)手足口病腸道病毒的檢測(cè)效果。方法：選擇我市2018年1月至2018年12月的225例手足口病患兒，均行RT-PCR和熒光探針PCR檢測(cè)，對(duì)比RT-PCR和熒光探針PCR兩種方法的病毒陽(yáng)性檢出率，包括通用型腸道病毒、EV71、CoxA16。結(jié)果：熒光探針PCR對(duì)通用型腸道病毒、EV71、CoxA16等手足口病腸道病毒的檢出率明顯高于RT-PCR法，差異對(duì)比顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：與RT-PCR相比，熒光探針PCR對(duì)手足口病腸道病毒的陽(yáng)性檢出率較高，值得臨床推廣應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】RT-PCR;熒光探針PCR;手足口病腸道病毒;陽(yáng)性檢出率

【中圖分類(lèi)號(hào)】R446??????【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A??????【文章編號(hào)】1004-7484（2019）07-0138-01

手足口病是因腸道病毒感染引起的一種傳染性疾病，多發(fā)于嬰幼兒中，會(huì)引起小兒的足、手、口腔等部位發(fā)生皰疹，部分患兒甚至?xí)鸱嗡[、心肌炎或無(wú)菌性腦膜炎等嚴(yán)重的并發(fā)癥^[1-2]，其中會(huì)引起手足口病的常見(jiàn)病包括科薩奇病毒A組16、4、5、9、10型，腸道病毒71型（EV71）及B組的2、5型，其中最為常見(jiàn)的病原體類(lèi)型為腸道病毒EV71型及柯薩奇病毒A組的16型^[3]，因此對(duì)其進(jìn)行早期、準(zhǔn)確診斷非常重要，以往多采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶連反應(yīng)（RT-PCR）周期較長(zhǎng)，不利于快速診斷，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種新興的用于病原體核酸快速檢測(cè)的技術(shù)^[4]。本文分析了RT-PCR和熒光探針PCR對(duì)手足口病腸道病毒的診斷價(jià)值，以為手足口病腸道病毒檢測(cè)選擇合適的診斷方法，現(xiàn)進(jìn)行如下報(bào)告。

1 資料與方法

1.1一般資料

選擇我市2018年1月至2018年12月的225例手足口病患兒，所有患兒的發(fā)病時(shí)間均小于7d，排除免疫性疾病、感染性疾病及其他伴發(fā)疾病等。其中男115例，女110例，年齡范圍為8個(gè)月～4歲，平均年齡為3.1±0.9歲。

1.2方法

RNA提取試劑盒購(gòu)自Roch公司，核酸分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 DNA marker購(gòu)自TaKaRa公司，逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增采用Titan One Tube RT-PCR Kit;熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)自江蘇碩世生物科技股份有限責(zé)任公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀器為AB 公司的StepOne，瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)購(gòu)自北京六一公司。

熒光探針PCR法：取原始樣本200μl，用固相提取法中的柱式提取法對(duì)RNA進(jìn)行提取，并采用PCR核酸擴(kuò)增檢測(cè)儀進(jìn)行擴(kuò)增，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行溫度條件、循環(huán)擴(kuò)增參數(shù)設(shè)置，并設(shè)置陰性及陽(yáng)性對(duì)照組。

RT-PCR：引物序列符合《手足口病診斷》標(biāo)準(zhǔn)（WS 588-2018），反應(yīng)條件為50°C下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄半小時(shí)，之后94°C下2min，94°C下30s，45°C下30s，68°C下45s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)后在68°C下7min，之后轉(zhuǎn)入4°C。

1.3觀察指標(biāo)

對(duì)比RT-PCR和熒光探針PCR兩種方法的病毒陽(yáng)性檢出率，包括通用型腸道病毒、EV71、CoxA16。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理與分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料用n或百分比表示，對(duì)比分析采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)果

表1結(jié)果表明，熒光探針PCR對(duì)通用型腸道病毒、EV71、CoxA16等手足口病腸道病毒的檢出率明顯高于RT-PCR法，差異對(duì)比顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3?討論

目前，手足口病檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)方法是用分離、鑒定病毒的方法，常用分離方法包括乳鼠接種及細(xì)胞接種，但因細(xì)胞對(duì)病毒的敏感性導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變的周期較長(zhǎng)，且因病毒抗原漂移容易受到阻礙，且接種乳鼠的鑒別過(guò)程繁瑣耗時(shí)，因此其不適用于短時(shí)間內(nèi)處理大量樣本，也不滿足臨床早診斷及早干預(yù)的需要，且會(huì)出現(xiàn)難以采集合格標(biāo)本的情況，從而無(wú)法對(duì)病毒進(jìn)行檢測(cè)，腸道病毒特異性鑒定可采用血清中和實(shí)驗(yàn)，多見(jiàn)于手足口病無(wú)癥狀的腸道病毒感染，但其檢測(cè)方法特異性較低^[5]，因此需采用合適的檢測(cè)方法，本文分析了熒光探針PCR對(duì)手足口病腸道病毒的檢測(cè)效果。

本文結(jié)果表明，熒光探針PCR對(duì)通用型腸道病毒、EV71、CoxA16等手足口病腸道病毒的檢出率明顯高于RT-PCR法，差異對(duì)比顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），主要是由于熒光探針PCR具有快速、定量檢測(cè)、靈敏度、特異度高且自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)^[6]，因此其可用于手足口病腸道病毒的檢測(cè)。

綜上所述，與RT-PCR相比，熒光探針PCR對(duì)手足口病腸道病毒的陽(yáng)性檢出率較高，值得臨床推廣應(yīng)用。

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