RAI14在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

劉成業(yè) 何新陽(yáng) 金榮 趙亞軍 王曉秋 田銳

【摘 ?要】目的：探索維甲酸誘導(dǎo)蛋白14（Retinoic Acid Induced 14， RAI14）在胃癌組織中的表達(dá)水平，并分析其表達(dá)水平的臨床意義。方法：通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)2019年1月至2019年3月期間42例胃癌患者的新鮮胃癌組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本RAI14 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。另通過免疫組織化學(xué)法檢測(cè)2011年3月至2013年5月期間于我院胃腸外科病區(qū)住院行手術(shù)治療的122例患者的胃癌組織及其對(duì)應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本RAI14蛋白的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)RAI14在胃癌組織中的表達(dá)水平，分析其及與患者臨床病理特征的關(guān)系。通過單因素、多因素分析，分析胃癌組織中的RAI14表達(dá)水平與患者預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果：胃癌組織中RAI14 mRNA的表達(dá)水平明顯高于其癌旁正常組織（P<0.05）。免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示RAI14在胃癌組織中的表達(dá)陽(yáng)性率高于癌旁正常組織（P<0.05）。RAI14陰性組的生存率高于陽(yáng)性組（P<0.05）。腫瘤的分化程度、直徑、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量與胃癌組織RAI14蛋白的過度表達(dá)有關(guān)（P<0.05）。單因素分析顯示腫瘤RAI14表達(dá)異常、腫瘤直徑、浸潤(rùn)深度、分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目與胃癌患者預(yù)后存在一定的相關(guān)性（P<0.05），Cox多因素分析可見RAI14表達(dá)異常、浸潤(rùn)深度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素（P<0.05）。結(jié)論：胃癌組織中存在明顯的RAI14異常表達(dá)，RAI14過表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展存在一定的相關(guān)性，也有助于判斷胃癌患者的預(yù)后，因此RAI14有望成為一項(xiàng)新型的胃癌腫瘤標(biāo)記物。

【關(guān)鍵詞】RAI14;胃癌;qRT-PCR;免疫組織化學(xué)法;預(yù)后

【中圖分類號(hào)】R197??????【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A??????【文章編號(hào)】1004-7484（2019）07-0078-03

Expression of RAI14 in gastric cancer tissues and its clinical significance★

LIU Chengye， HE Xinyang*， JIN Rong， ZHAO Yajun， WANG Xiaoqiu， TIAN Rui

（Department of general surgery， provincial hospital affiliated to anhui medical university， Hefei， Anhui， 230001， China）

【Abstract】Objective： To explore the expression of 14 （Retinoic Acid Induced 14， RAI14） in gastric carcinoma and to analyze its clinical significance. Methods：?Real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） was used to detect the relative expression of RAI14 mRNA in 42 fresh gastric cancer tissues and their corresponding normal adjacent tissues from January 2019 to March 2019. The expression of RAI14 protein in gastric cancer tissues and corresponding normal tissues of 122 patients hospitalized in gastrointestinal surgery ward of our hospital from March 2011 to May 2013 was detected by immunohistochemical method. The expression level of RAI14 in gastric cancer was analyzed and its relationship with clinicopathological features was analyzed. The correlation between RAI14 expression and prognosis in gastric cancer was analyzed by univariate and multivariate analysis. Results：?The expression level of RAI14 mRNA in gastric cancer tissues was significantly higher than that in paracancerous normal tissues （P < 0.05）. The positive rate of RAI14 expression in gastric cancer tissues was higher than that in adjacent normal tissues （P < 0.05）.The survival rate of RAI14 negative group was higher than that of positive group（P < 0.05）.The degree of differentiation， diameter， depth of invasion and the number of lymph node metastasis were related to the overexpression of RAI14 protein in gastric cancer（P<0.05）.Univariate analysis showed that abnormal expression of RAI14， tumor diameter， depth of invasion， degree of differentiation and number of lymph node metastasis were correlated with prognosis of patients with gastric cancer （P < 0.05）. Cox multivariate analysis showed that abnormal expression of RAI14， number of lymph node metastasis and depth of invasion were independent factors affecting the prognosis of patients with gastric cancer. Conclusion：There is obvious abnormal expression of RAI14 in gastric cancer. There is a certain correlation between the overexpression of RAI14 and the occurrence and development of gastric cancer， and it is also helpful to judge the prognosis of patients with gastric cancer. RAI14 is expected to become a new type of gastric cancer tumor marker.

【Key words】?Retinoic acid induced 14 （RAI14）; Gastric cancer; RT-PCR; Immunohistochemical method; ?Prognosis

前言

胃癌是世界上最常見的高發(fā)病率腫瘤之一，其致死率在所有癌癥中也高居第三位^[1-5]。與此同時(shí)，相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示：在我國(guó)，胃癌發(fā)病率和死亡率均高居第二位^[6]。因?yàn)樵缙谖赴┐蠖酂o癥狀或癥狀輕微，所以當(dāng)臨床癥狀明顯時(shí)大部分胃癌患者已處于進(jìn)展期，因此失去了最好的治療機(jī)會(huì)，而且這些患者的總體預(yù)后很差^[7-9]。目前胃癌的主要治療手段是以手術(shù)為中心的多學(xué)科綜合治療^[10]，但因其易復(fù)發(fā)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和產(chǎn)生化療耐藥性，胃癌的總的5年生存率僅為35.9%左右^[11]，因此找到一個(gè)可以用于胃癌診斷和治療，并且可以評(píng)估患者預(yù)后的標(biāo)志物，成為臨床研究的重點(diǎn)。

維甲酸誘導(dǎo)蛋白14（Retinoic Acid Induced 14，RAI14）是通過對(duì)視黃酸誘導(dǎo)人類視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（RPE）細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19發(fā)現(xiàn)并克隆對(duì)新基因^[12]。最近的研究表明，維甲酸誘導(dǎo)蛋白14可能在化療耐藥性，癌細(xì)胞增殖和某些惡性腫瘤侵襲過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，然而，有關(guān)RAI14在胃癌中的表達(dá)水平、臨床預(yù)后意義以及其與腫瘤血管生成的潛在機(jī)制尚未得到充分研究。本研究檢測(cè)了胃癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中RAI14的表達(dá)，分析了RAI14在胃癌組織中的表達(dá)情況，并探討其與胃癌患者的臨床病理特征、參數(shù)以及生存率等資料之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2019年1月至2019年3月間在中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科病區(qū)手術(shù)治療的42例胃癌患者的癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織（距腫塊邊緣距離>5cm）標(biāo)本，手術(shù)切除病灶后，迅速將新鮮病灶組織置于無菌試管中，-80℃保存?zhèn)溆茫糜趒RT-PCR檢測(cè);另選取2011年3月至2013年5月在中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院122例行手術(shù)治療的患者的胃癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本，其中男性83例，女性39例。年齡為29～81歲，中位年齡61歲。標(biāo)本經(jīng)固定、包埋、切片后進(jìn)行免疫組織化學(xué)法檢測(cè)。本研究所有病例均為原發(fā)性胃癌，不包括家族腫瘤的遺傳史，術(shù)前未進(jìn)行放療和化療。術(shù)后病理證實(shí)為胃腺癌。

1.2 主要試劑與儀器

PCR試劑與儀器：Life Technogies公司提供的TRIzolRNA 抽提試劑盒，上海聯(lián)邁生物提供的pcr引物，廣州東盛生物科技提供的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，羅氏公司的LightCycler 96熒光定量PCR儀及其配套的熒光定量PCR試劑盒。

免疫組織化學(xué)試劑與儀器：艾博抗（上海）貿(mào)易提供的一抗體兔抗人Rai14，福州邁新生物提供的新型酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物、基因科技（上海）提供的DAB顯色盒及免疫組織化學(xué)染色試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR檢測(cè) ?按照產(chǎn)品使用說明，將得到癌旁正常組織和癌組織分別稱重，切碎，在液氮中研磨，并加以TRIzol試劑進(jìn)行裂解處理。加入氯仿，劇烈振蕩，放置室溫下。 4℃條件下，以 12000rpm轉(zhuǎn)速離心，收集上清（約500ul），并加入異丙醇進(jìn)行混勻。冰上孵育。再次離心后棄去上清液。 加入預(yù)冷的 75℅乙醇。4℃ 12000rpm離心，棄上清。 重復(fù)步驟上述步驟，RNA沉淀在室溫下干燥，提取出總RNA，并保存在-80℃條件下備用。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，以此為熒光定量模板，用熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行檢測(cè)PCR。RAI14基因的特異引物：順向5‘端引物5‘- GGAAGCCAGTGATGAAGCTG -3‘;反向3‘端引物5‘- TCAGCCTGGGCTTCTTTGTA -3‘;長(zhǎng)度111 bp;基因的定量分析使用β-actin作為對(duì)照，順向5‘端引物5‘- CCCTGGAGAAGAGCTACGAG-3‘;反向3‘端引物5‘- GGAAGGAAGGCTGGAAGAGT-3‘;長(zhǎng)度96 bp。RAI14 mRNA的相對(duì)表達(dá)量運(yùn)用2 -ΔΔCt 法進(jìn)行計(jì)算。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色及其評(píng)價(jià) ?將組織切片現(xiàn)經(jīng)二甲苯脫蠟后 再予以濃度梯度酒精置換后，然后選取磷酸緩沖鹽溶液（PBS）進(jìn)行沖洗。常溫下用3%H₂0₂?進(jìn)行孵育10 min左右，再選取95°C檸檬酸緩沖液（pH6.0）進(jìn)行沖洗以修復(fù)抗原，繼續(xù)在室溫下加入非免疫性山羊血清孵育15min左右，以達(dá)到阻斷非特異性免疫反應(yīng)的作用。將組織表面滴加（將稀釋成1：100的一抗兔抗人RAI14低于切面上，并在4℃條件下孵育過夜。第二天復(fù)溫0.5h，PBS緩沖液沖洗3次，加入二抗，孵育0.5h后滴加新鮮的DAB顯色劑進(jìn)行顯色，隨后用蘇木精復(fù)染，流水沖洗，脫水干燥并封固，最后在顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.4 結(jié)果判定 ?光鏡下觀察整個(gè)切片，每例切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野（×200），根據(jù)切片陽(yáng)性染色強(qiáng)度分級(jí)及細(xì)胞染色比例分級(jí)的總評(píng)分進(jìn)行判定結(jié)果。其中無著色、淡黃色、棕黃色以及棕褐色的陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度分別為0、1、2、3分;陽(yáng)性細(xì)胞染色比例占比0%、不足20%、20～50%、高于50%的評(píng)分分別為0、1、2、3分?？偡帧?分為陰性，即低表達(dá)）;總分>2分視為陽(yáng)性，即高表達(dá)。

1.5 隨訪 ?對(duì)患者進(jìn)行隨訪，隨訪的方式包括門診或電話等，隨訪截止時(shí)間2018年12月。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 ?采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料通過χ2檢驗(yàn)分析;RAI14的過表達(dá)與胃癌患者總生存期（OS）的相關(guān)性應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線進(jìn)行分析;并對(duì)胃癌患者預(yù)后的相關(guān)因素進(jìn)行單因素分析及Cox回歸多因素分析。P<0.05即差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RAI14 mRNA在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)

圖1可見胃癌組織中RAI14 mRNA的表達(dá)水平為（8.48±7.46）顯著高于其癌旁正常組織的（2.52±3.19），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.976，P<0.05）。

2.2 ?RAI14蛋白在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)情況

表1，圖2顯示RAI14在胃癌組織中的表達(dá)陽(yáng)性率為72.2%（88/122），高于癌旁正常組織的30.4%（37/122），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ²=42.665，P<0.05）。

2.3 ?RAI14蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

表2可見，腫瘤的分化程度、直徑、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量與胃癌組織RAI14蛋白的過度表達(dá)有關(guān)（P<0.05）。而年齡、性別差異與RAI14蛋白的過度表達(dá)無關(guān)（P>0.05）。

2.4 ?RAI14蛋白在胃癌組織的表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存曲線分析可見RAI14陰性組的生存率高于陽(yáng)性組（χ²=10.939，P<0.05）。表3的單因素分析顯示腫瘤RAI14表達(dá)異常、腫瘤直徑、浸潤(rùn)深度、分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目與胃癌患者預(yù)后存在一定的相關(guān)性（P<0.05），表4的Cox多因素分析可見RAI14表達(dá)異常、浸潤(rùn)深度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素（P<0.05）。

3 討論

胃癌是一種全球常見的實(shí)體惡性腫瘤，其預(yù)后差，容易復(fù)發(fā)和發(fā)生轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響人類健康^[12]。RAI14基因是由Kutty等于2001年發(fā)現(xiàn)的^[13]，該基因定位于5p13.2～13.3，由于不同的剪切機(jī)制，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有5kb和3kb左右兩種形式，在人和小鼠中具有很高的同源性，達(dá)到91%。在人類中，其cDNA全長(zhǎng)4925bp，編碼980氨基酸，蛋白大小約110kDa。值得注意的是，RAI14蛋白結(jié)構(gòu)上有兩個(gè)重要特點(diǎn)：一是在蛋白的C端有一個(gè)大的螺旋-螺旋結(jié)構(gòu)域，覆蓋了整個(gè)蛋白質(zhì)的60%，這樣的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)成為蛋白自身聚合或與其它蛋白相互作用的基礎(chǔ);第二是在N端有6個(gè)重復(fù)的錨蛋白序列（每個(gè)重復(fù)序列包含33個(gè)氨基酸），它們是蛋白質(zhì)相互結(jié)合的場(chǎng)所。同時(shí)Kutty應(yīng)用Nothern blotting和原位雜交進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，該基因在多種腫瘤細(xì)胞（腺性結(jié)腸癌SW480、肺癌細(xì)胞A549、淋巴瘤K-562、Hela cell s3等）也有高表達(dá)，這一結(jié)果提示RAI14基因可能在細(xì)胞增殖以及腫瘤的發(fā)生中承擔(dān)著重要角色^[13]。

最近的研究表明，RAI14可能在化療耐藥性、癌細(xì)胞增殖和某些惡性腫瘤侵襲過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。例如，Hsu等進(jìn)行了全基因組分析以鑒定與抗腫瘤藥物（包括紫杉醇、多西紫杉醇、厄洛替尼、依維莫司和達(dá)沙替尼）顯著相關(guān)的一組8個(gè)基因，（EGFR、ITGA3、MYLK、RAI14、AHNAK、GLS、IL32和NNMT）^[14]。Hawkins等發(fā)現(xiàn)NR2F2可以通過調(diào)節(jié)NEK2、RAI14參與卵巢癌細(xì)胞周期相關(guān)的多種基因的表達(dá)^[15]。Paez等已經(jīng)證明RAI14參與前列腺癌細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)^[16]。此外，Zhou等結(jié)合生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法鑒定出RAI14是胃癌中與藥物反應(yīng)相關(guān)的基因之一^[17]。然而，在肺腺癌中發(fā)現(xiàn)不一致的現(xiàn)象，Yuan等發(fā)現(xiàn)RAI14肺癌組織及細(xì)胞系A(chǔ)549高表達(dá)，但高表達(dá)RAI14顯著抑制了肺腺癌細(xì)胞增殖^[18]。

胃癌具有較強(qiáng)的富血管性，其生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的生成^[19-21]。理論上，血管靶向治療是一種有效的抗癌途徑。然而，臨床實(shí)踐表明抗血管生成藥物對(duì)晚期胃癌患者生存期的影響十分有限，目前被臨床證實(shí)有效的小分子靶向藥僅有阿帕替尼一種^[22-25]。因此，找尋新的抗血管生成治療靶點(diǎn)也一直是胃癌研究領(lǐng)域的重點(diǎn)方向之一。

本研究通過胃癌組織和癌旁正常組織中RAI14 mRNA表達(dá)和RAI14蛋白表達(dá)情況進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)癌組織中RAI14 mRNA的表達(dá)和RAI14蛋白表達(dá)均要顯著高于癌旁正常組織。進(jìn)一步分析顯示腫瘤的分化程度、直徑、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量與胃癌組織RAI14蛋白的過度表達(dá)有關(guān)（P<0.05）。而RAI14陰性組的生存率高于陽(yáng)性組（P<0.05）。單因素和Cox多因素分析顯示RAI14表達(dá)異常、浸潤(rùn)深度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素（P<0.05）。結(jié)果提示胃癌組織中存在明顯的RAI14異常表達(dá)，這種異常表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展存在一定的相關(guān)性，且對(duì)于判斷胃癌患者的預(yù)后也能提供一定的參考價(jià)值。

綜上所述， 胃癌組織中存在明顯的RAI14異常表達(dá)，RAI14過表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展存在一定的相關(guān)性，也有助于判斷胃癌患者的預(yù)后，因此RAI14有望成為一項(xiàng)新型的胃癌腫瘤標(biāo)記物?；谏鲜隹茖W(xué)理論，接下來我們將圍繞RAI14參與調(diào)控胃癌血管生成作用及機(jī)制進(jìn)一步探索與研究。

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項(xiàng)目基金：

安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：1908085MH282）;CSCO-恒瑞腫瘤研究基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：Y-HR2017-021）