基于調(diào)酸實(shí)現(xiàn)的大豆油體富集物的分離研究

居巧苓，張彩猛，孔祥珍，華欲飛，陳業(yè)明

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

油體是大豆等油料種子細(xì)胞中的貯油細(xì)胞器，是一種天然乳化的球形油滴粒子，其內(nèi)部為甘油三酯，表面是一層蛋白-磷脂膜[1]。對于大豆油體，其天然狀態(tài)時(shí)含有約92%甘油三酯、5%蛋白質(zhì)和3%磷脂[2]。另外，大豆油體中還含有維生素E和甾醇等油溶性成分[2]。因此，大豆油體可作為一種新型的油脂產(chǎn)品[3]。日本不二制油株式會(huì)社在2013年基于“ultra soy separation(USS)”專利技術(shù)推出了大豆奶油(soymilk cream；實(shí)際上是大豆油體富集物的乳狀液)系列產(chǎn)品[4]，如色拉醬、打發(fā)奶油和涂抹奶油等，經(jīng)濟(jì)附加值是傳統(tǒng)豆制品的數(shù)倍。國內(nèi)還沒有大豆油體富集物的相關(guān)產(chǎn)品，目前還處在實(shí)驗(yàn)室研究階段，如對大豆水相提取物進(jìn)行高速離心得到上浮輕相(大豆油體富集物)[5]，或在大豆水相提取物中加入復(fù)合酶(如纖維素酶和果膠酶)、高濃度鹽和蔗糖等，酶解一段時(shí)間后，再在比較低的離心力下離心得到上浮輕相[6]。

大豆經(jīng)過浸泡和磨漿后，細(xì)胞微結(jié)構(gòu)被破壞，其中的油體、蛋白質(zhì)和碳水化合物等釋放進(jìn)入液相，通過除渣，即得含有上述成分的生豆?jié){[7]。一般而言，豆?jié){中的蛋白質(zhì)含量是脂質(zhì)含量的2倍左右。蛋白質(zhì)成分包括球蛋白(glycinin，11S)、伴球蛋白(β-conglycinin，7S)、清蛋白(脂肪氧合酶(LOX)、β-淀粉酶、Kunitz型胰蛋白酶抑制劑(KTI)、Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑(BBI))及一些小肽和游離氨基酸[8]。豆?jié){的脂質(zhì)成分主要來源于油體，還有少部分是在磨漿過程中吸附在球蛋白和伴球蛋白等分子表面的極性脂質(zhì)[9]。研究表明，油體表面由油體膜蛋白(包括油體蛋白、油體鈣蛋白和油體固醇蛋白)和磷脂等極性脂覆蓋[10]。大豆油體與其他油料種子的油體相比，粒徑較小(平均直徑為400 nm)[11]。因此，在工業(yè)化生產(chǎn)的情況下，只有通過具有較大離心力的碟式離心機(jī)才能將其作為輕相有效分離，這給大規(guī)模生產(chǎn)帶來了高要求。

“USS”即是利用上述原理的技術(shù)，對生豆?jié){進(jìn)行一定處理后，通過碟式離心機(jī)將油體作為輕相分離出來，即為大豆油體富集物，重相部分為含有少量油體的低脂大豆蛋白液。需要說明的是：“USS”技術(shù)所得的大豆油體富集物含有一定量的大豆蛋白，約為脂肪量的一半。這是因?yàn)樯節(jié){中的油體表面會(huì)吸附一些大豆蛋白，這些蛋白在離心過程中隨油體一起進(jìn)入輕相被分離出來。

基于大豆油體在加工過程中與蛋白質(zhì)的相互作用[12]，本文擬通過增加油體表面蛋白吸附量來使油體通過離心沉淀(該沉淀即為大豆油體富集物，蛋白質(zhì)含量比“USS”技術(shù)高)，以此降低對離心設(shè)備的高要求，也可避開“USS”專利的技術(shù)壁壘。該方法主要基于大豆球蛋白、油體和大豆伴球蛋白的不同帶電性(球蛋白pI 6.4[13]，油體pI 5.7[14]，伴球蛋白pI 4.8[13])。在一定的酸性pH下，油體與蛋白質(zhì)發(fā)生聚集形成粒徑較大的聚集體(油體-蛋白質(zhì)聚集體)，可被低離心力離心沉淀，從而實(shí)現(xiàn)與其余未聚集蛋白的分離。此方法操作較為簡單，對設(shè)備要求不高，豆制品或大豆蛋白加工廠通過簡單的設(shè)備改造即可實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)，對我國大豆產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

大豆，九三牌；鹽酸，國藥化學(xué)試劑有限公司；丙烯酰胺、N，N′-甲叉雙丙烯酰胺、溴酚藍(lán)、巰基乙醇、三羧基氨基甲烷、甘氨酸、四甲基乙二胺和考馬斯亮藍(lán)G250，美國Sigma公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白，美國Bio-Rad公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

MJ-60BE01B打漿機(jī)，美的電器有限公司；PHS-3C型pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；HimacCR-21G型離心機(jī)，日本Hitachi公司；KDN-08型消化爐；海能K9840自動(dòng)凱氏定氮儀；BE-210G電泳儀，日本Bio-Craft株式會(huì)社；Agilent 1100型全自動(dòng)氨基酸分析儀，美國Agilent公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生豆?jié){的制備

大豆用去離子水清洗3遍后，4℃浸泡18 h，用去離子水清洗2遍，按照豆水質(zhì)量比1∶9打漿2 min。200目尼龍紗布過濾，得生豆?jié){。

1.2.2 大豆油體富集物的分離

用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)生豆?jié){的pH至6.1、6.0、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4，攪拌10 min，5 000g(離心力可以更小，本研究為了方便樣品的收集，選擇了較大的離心條件)下離心45 min，得到兩相——上層液相和下層沉淀，分別收集。下層沉淀即為大豆油體富集物。

1.2.3 基本成分測定

固形物含量，烘箱烘干法(105℃，3 h)；蛋白質(zhì)含量，凱氏定氮法；脂肪含量，堿水解法(GB 5413.3—2010)。

1.2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量

參考Laemmli[15]的方法，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)12.5%。樣品溶解液為0.25 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 6.8)、1%SDS、2%巰基乙醇(非還原電泳不添加)和0.02%溴酚藍(lán)。將樣品的蛋白質(zhì)含量調(diào)節(jié)至2 mg/mL，與等體積的樣品溶解液混合均勻，在沸水浴中加熱5 min。每個(gè)樣品用微量進(jìn)樣針加10 μL，在濃縮膠中的電流為15 mA，樣品進(jìn)入分離膠后將電流調(diào)為25 mA，直至電泳結(jié)束。所得膠用凝膠成像儀拍照分析。

1.2.5 氨基酸分析

將樣品加入水解管，再加入12 mol/L HCl，在110℃下水解22 h。具體操作按照氨基酸分析說明書步驟進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸性pH對生豆?jié){固形物、脂肪和蛋白質(zhì)沉降的影響(見圖1)

圖1a顯示：pH 6.1時(shí)，沉淀質(zhì)量約占生豆?jié){質(zhì)量的9%；隨pH降低，沉淀的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增大；pH 5.7之后，沉淀的質(zhì)量分?jǐn)?shù)趨于恒定(約12%)。圖1b顯示：pH 6.1時(shí)，約32%的固形物分布在沉淀中；隨pH降低，沉淀中分布的固形物越來越多；pH 5.4時(shí)，約有62%的固形物分布在沉淀中。圖1c顯示：pH 6.1時(shí)，約34%的蛋白質(zhì)分布在沉淀中；隨pH降低，沉淀中分布的蛋白質(zhì)越來越多；pH 5.4時(shí)，沉淀中分布的蛋白質(zhì)約為總蛋白質(zhì)的74%。圖1d顯示：pH 6.1時(shí)，約60%的脂肪分布在沉淀中；隨pH降低，沉淀中分布的脂肪越來越多；pH 5.4時(shí)，約98%的脂肪分布在沉淀中。

2.2 酸性pH對生豆?jié){離心后的液相和沉淀組成的影響(見圖2)

圖2 酸性pH對生豆?jié){離心后的液相和沉淀組成的影響

圖2a顯示：pH 6.1時(shí)，沉淀的固形物含量約為20%；隨pH降低，固形物含量越來越高；pH 5.4時(shí)，固形物含量約為28%。該結(jié)果說明，pH降低會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)與水之間的相互作用越來越弱。圖2b顯示：pH 6.1～5.9時(shí)，沉淀中脂肪/蛋白質(zhì)比值接近于1；pH 5.8之后，脂肪/蛋白質(zhì)比值越來越低；脂肪/固形物比值的變化趨勢與脂肪/蛋白質(zhì)比值類似，pH 6.1～5.9時(shí)，脂肪/固形物比值接近于0.46，之后慢慢減小。從大豆油體富集物的得率和油體富集度的角度考慮，應(yīng)選擇pH 5.9進(jìn)行大豆油體富集物的分離制備。在得到大豆油體富集物的同時(shí)，還可得到液相部分，液相部分可作為一種低脂大豆蛋白飲品。圖2c顯示：pH 6.1時(shí)，液相中的脂肪是蛋白質(zhì)的1/3；pH 5.9～5.8時(shí)，脂肪約是蛋白質(zhì)的1/5；隨pH繼續(xù)降低，脂肪/蛋白質(zhì)比值越來越低。

本研究所使用生豆?jié){的固形物含量為5.6%，蛋白質(zhì)含量為2.5%，脂肪含量為1.4%。以pH 5.9條件為例，100 g生豆?jié){可得10 g大豆油體富集物，其固形物含量約為22%，脂肪含量約為10%，蛋白質(zhì)含量約為10%；100 g生豆?jié){可得到90 g液相，固形物含量約為3.7%，蛋白質(zhì)含量約為1.6%，脂肪含量約為0.4%。鑒于本方法的原理，所得大豆油體富集物中的脂肪含量低于“USS”技術(shù)(約13%)，而蛋白質(zhì)含量要高于“USS”技術(shù)(約5.5%)。本方法所得大豆油體富集物外觀與奶油極為相似，由于較高的蛋白質(zhì)含量，具有較好的凝膠性和乳化性等功能性質(zhì)，可加工成布丁等甜品和色拉醬等；所得液相部分可作為一種低脂大豆蛋白飲品，風(fēng)味清新、口感清爽。

2.3 油體在液相和沉淀分布情況分析

本研究是基于如下原理進(jìn)行的：通過調(diào)節(jié)生豆?jié){的pH，使得大豆油體與蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，形成尺寸較大的大豆油體-蛋白質(zhì)聚集體；如果聚集體的密度大于生豆?jié){密度，那么離心可將聚集體沉淀；如果密度小于或等于生豆?jié){密度，那么離心則不會(huì)使聚集體沉淀。為了驗(yàn)證上述原理，設(shè)計(jì)了如下試驗(yàn)：將生豆?jié){的pH調(diào)至6.4、6.2、6.0、5.8、5.6、5.4，超速離心(197 000g，30 min)得到如下分離情況(見圖3)。

注：箭頭所指部分為吸附較少蛋白質(zhì)的油體

圖3顯示：pH 5.4～5.6條件下，生豆?jié){分成了液相和沉淀部分；pH 5.8～6.4條件下，分成了上浮、液相和沉淀部分。該結(jié)果說明，pH 5.8～6.4條件下，油體與蛋白質(zhì)的相互作用并不是均勻的，有的油體結(jié)合相對較多的蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)/油體比值大)，有的油體結(jié)合相對較少的蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)/油體比值小)，使得油體-蛋白質(zhì)聚集體的密度不盡相同，從而使得有的油體-蛋白質(zhì)聚集體沉淀，有的上??；pH 5.4～5.6條件下，與油體相互作用的蛋白質(zhì)量足夠多，從而使得油體幾乎全部沉淀。

2.4 酸性pH對生豆?jié){各蛋白質(zhì)成分沉降的影響

對不同pH條件下的液相部分進(jìn)行還原和非還原SDS-PAGE分析，結(jié)果分別見圖4a和圖4b。

注：M為Marker；LOX為脂肪氧合酶；KTI為Kunitz型胰蛋白酶抑制劑；α′、α和β為β-伴球蛋白(7S)的3個(gè)亞基；AB為大豆球蛋白(11S)的亞基；A和A3為11S的酸性肽鏈；B為11S的堿性肽鏈。

圖4 不同pH條件下液相部分還原與非還原SDS-PAGE圖譜

圖4a和圖4b顯示：隨pH降低，11S逐漸減少；pH 小于等于5.6的條件下，11S基本沉降進(jìn)入沉淀。利用Image Lab 3.0軟件(Bio-Rad公司)分析各條帶的強(qiáng)度比例，再結(jié)合液相的蛋白質(zhì)含量，可計(jì)算得到各蛋白成分(7S，11S和其他蛋白)在100 g生豆?jié){所得液相中的質(zhì)量，結(jié)果見圖5。

圖5顯示：100 g生豆?jié){含有2.5 g蛋白質(zhì)，其中0.70 g的7S，0.85 g的11S和0.95 g的其他蛋白；隨pH降低，11S快速減少，7S和其他蛋白緩慢減少；pH 6.1時(shí)，液相含有0.53 g的7S，0.47 g的11S和0.65 g的其他蛋白；pH 5.9時(shí)，液相含有0.48 g的7S，0.37 g的11S和0.58 g的其他蛋白；pH 5.5時(shí)，液相含有0.31 g的7S和0.42 g的其他蛋白，不含11S。

圖5 酸性pH對生豆?jié){液相部分各蛋白質(zhì)成分的影響

2.5 酸性pH對液相中氨基酸組成的影響(見表1)

表1顯示，液相中谷氨酸和谷氨酰胺含量隨pH下降而降低，天冬氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、精氨酸、丙氨酸和酪氨酸等顯示出緩慢上升的趨勢。

表1 不同pH條件下生豆?jié){離心所得液相的氨基酸組成及含量 %

3 結(jié) 論

將生豆?jié){調(diào)至酸性pH后，通過離心將生豆?jié){分成大豆油體富集物和低脂大豆蛋白液兩部分。隨著pH降低，越來越多的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)進(jìn)入沉淀，液相中11S/7S比值越來越小，在pH 5.5時(shí)，11S幾乎全部進(jìn)入沉淀；液相中的谷氨酸和谷氨酰胺的相對含量越來越小，其余氨基酸相對含量與原始豆?jié){相差不大。在綜合考慮大豆油體富集物的脂質(zhì)含量和低脂大豆蛋白液的蛋白質(zhì)含量的情況下，本研究認(rèn)為pH 5.9是較適的分離條件。在該條件下，可從100 g生豆?jié){分離得到10 g大豆油體富集物，其固形物含量約為22%，脂肪和蛋白質(zhì)含量都約為10%；相應(yīng)地，100 g生豆?jié){可分離得到90 g低脂大豆蛋白液，固形物、蛋白質(zhì)和脂肪含量分別為3.7%、1.6%和0.4%(本研究的原始生豆?jié){的固形物、蛋白質(zhì)和脂肪含量分別為5.6%、2.5%和1.4%)。