益生菌的篩選評(píng)價(jià)與產(chǎn)品質(zhì)量控制探討

蔣卉

摘 要：益生菌制劑作為一種無(wú)毒、無(wú)副作用的新型保健品，在人體中發(fā)揮著重要的作用，直接關(guān)系著人體的機(jī)能和生命健康。然而，我國(guó)益生菌產(chǎn)業(yè)起步較晚，技術(shù)尚不成熟，且缺乏健全完善的標(biāo)準(zhǔn)，市場(chǎng)監(jiān)控不到位，使得益生菌的產(chǎn)品質(zhì)量問(wèn)題受到廣泛關(guān)注。本文以益生菌的篩選評(píng)價(jià)指標(biāo)（即菌株的選擇標(biāo)準(zhǔn)、有效性評(píng)價(jià)和安全性評(píng)價(jià)）及產(chǎn)品質(zhì)量控制為出發(fā)點(diǎn)，對(duì)益生菌產(chǎn)品生產(chǎn)現(xiàn)狀、存在的問(wèn)題和對(duì)策進(jìn)行了探討。

關(guān)鍵詞：益生菌;菌株篩選;有效性;安全性;質(zhì)量控制

Abstract：As a new type of health care product without toxicity and side effects， probiotics preparation play an important role in human body and are directly related to human function and life health. However， the probiotics industry started late in China， the immature technology， the lack of perfect standards， and the lack of market monitoring， the quality of probiotics has received widespread attention. In this paper， starting from the screening evaluation index of probiotics and product quality control， the production status， existing problems and countermeasures of probiotics products were discussed.

Key words：Probiotics; Strain screening; Effectiveness; Security; Quality control

中圖分類(lèi)號(hào)：TS201.3

近年來(lái)，隨著微生態(tài)理論研究成果在實(shí)踐中的不斷應(yīng)用，益生菌得到了迅速發(fā)展。在我國(guó)，益生菌除了部分用于醫(yī)藥產(chǎn)品外，大部分都用于保健食品。益生菌作為維持人體生命活動(dòng)和身體機(jī)能的有益物質(zhì)，不僅對(duì)人類(lèi)健康發(fā)揮著重要的作用，也有效保證了人體生命體征的穩(wěn)定運(yùn)行，同時(shí)作為一類(lèi)生物活性制品，需保證益生菌菌株的穩(wěn)定、有效、安全。

世界衛(wèi)生組織對(duì)益生菌的定義為：一類(lèi)在攝入適當(dāng)數(shù)量后會(huì)對(duì)宿主機(jī)體產(chǎn)生益處的活體微生物。近年來(lái)，市場(chǎng)對(duì)益生菌的需求量日益增加，人們對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)問(wèn)題的關(guān)注度也日益提升，但我國(guó)還沒(méi)有明確規(guī)定相應(yīng)的評(píng)價(jià)指標(biāo)和評(píng)價(jià)方法。大部分企業(yè)在研發(fā)益生菌產(chǎn)品時(shí)，不對(duì)菌種進(jìn)行全面的安全性評(píng)價(jià)，且不同國(guó)家研究人員采用不同的評(píng)價(jià)指標(biāo)和評(píng)價(jià)方法。目前，益生菌產(chǎn)業(yè)處于發(fā)展階段，不僅種類(lèi)多，而且難以管理。因此，需要嚴(yán)格把關(guān)益生菌產(chǎn)品的生產(chǎn)過(guò)程，以確保益生菌的有效性和安全性。本文結(jié)合益生菌菌株的選擇標(biāo)準(zhǔn)、有效性評(píng)價(jià)、安全性評(píng)價(jià)，產(chǎn)品的質(zhì)量控制現(xiàn)狀、實(shí)際存在的問(wèn)題及其對(duì)策進(jìn)行了探討。

1 益生菌菌株的篩選

菌種是決定益生菌質(zhì)量的最關(guān)鍵因素。為保證篩選的益生菌菌種安全、高效，需確定菌種的生物學(xué)及其功能特性。對(duì)微生態(tài)制劑發(fā)展來(lái)說(shuō)，益生菌的選擇標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)價(jià)規(guī)程的建立非常重要。

1.1 益生菌菌株的選擇標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1 安全性

益生菌菌種應(yīng)來(lái)源清楚，有準(zhǔn)確的分類(lèi)，其本身沒(méi)有毒性、致病性和傳染性，包括代謝活動(dòng)和內(nèi)在微生物的屬性[1]，基因相對(duì)穩(wěn)定，不易突變，不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，符合國(guó)家相關(guān)法律法規(guī)。

1.1.2 抗逆性

益生菌菌株應(yīng)對(duì)高溫、高濕、胃酸、消化酶和膽鹽等環(huán)境有一定的耐受性，其生物活性得到保證，才能保證進(jìn)入人體發(fā)揮益生功能，保護(hù)腸道微生態(tài)平衡。

1.1.3 定植性

益生菌菌株能夠在消化道黏膜黏附并存活、穩(wěn)定定植在黏膜表面和產(chǎn)生代謝活性（如產(chǎn)生消化酶、有機(jī)酸等）。菌株能與常駐菌群競(jìng)爭(zhēng)，產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，還能與病原菌拮抗，具有調(diào)控免疫反應(yīng)的能力。因此，把益生菌在腸道黏附的定植性作為檢驗(yàn)其應(yīng)用效果好壞的重要指標(biāo)。

1.1.4 穩(wěn)定性

益生菌菌株具有遺傳穩(wěn)定性，尤其是經(jīng)過(guò)馴化、誘變和基因重組的菌種，應(yīng)具有穩(wěn)定的生物學(xué)和遺傳學(xué)特性，突變率低，避免產(chǎn)生毒副作用[2-3]。同時(shí)，菌株應(yīng)具有較好的可控性，確保在加工、貯藏和運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中能維持其功能特性的穩(wěn)定性，使益生菌具有良好的活性、理想的風(fēng)味和工藝特性。

1.1.5 有效性

益生菌能發(fā)揮至少一種有科學(xué)依據(jù)支撐的可促進(jìn)健康的作用。選擇益生菌時(shí)，必須根據(jù)生理需要，選擇可在人體中發(fā)揮作用的益生菌，以確保其應(yīng)用效果。

1.2 菌株的有效性評(píng)價(jià)

1.2.1 對(duì)胃酸、膽酸耐受性分析

人體胃酸（pH為2.0～3.0）環(huán)境能夠殺滅攝入的大部分微生物[4]。為保證益生菌在胃腸道內(nèi)發(fā)揮益生作用時(shí)的活菌數(shù)目，耐酸能力是益生菌必備的特征。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)菌株的耐酸試驗(yàn)還沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，通常選擇pH為1.0～5.0。

益生菌產(chǎn)品的特征指標(biāo)之一是益生菌對(duì)膽鹽的耐受性。人體小腸中膽汁酸鹽濃度水平平均在0.3%[5-6]，該指標(biāo)是影響菌株存活率的重要因素。膽汁鹽的耐受性隨著益生菌種類(lèi)的不同而有所差異。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)菌株的耐膽鹽試驗(yàn)還沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，通常選擇膽鹽濃度在0.1%～1.0%范圍內(nèi)。

1.2.2 對(duì)溫度耐受性分析

對(duì)溫度耐受性強(qiáng)的菌株，其產(chǎn)品的保質(zhì)期也更長(zhǎng)。將活化的待測(cè)菌株在一定溫度下水浴一定時(shí)間，隨后在冷水中快速降溫，經(jīng)培養(yǎng)后檢測(cè)菌株的存活率。

1.2.3 黏膜/上皮細(xì)胞黏附性分析

黏附試驗(yàn)常選人腸道細(xì)胞、豬腸道細(xì)胞和雞腸道細(xì)胞作為研究模型。黏附性的分析方法有：①貼壁共培養(yǎng)測(cè)定活菌數(shù)。將待測(cè)菌與細(xì)胞共培養(yǎng)，清洗去除未黏附的細(xì)菌后，處理細(xì)胞，釋放黏附在細(xì)胞上的待測(cè)菌[7-9]，通過(guò)測(cè)定活菌數(shù)，計(jì)算黏附率。②貼壁共培養(yǎng)染色觀察計(jì)數(shù)。將待測(cè)菌與細(xì)胞共培養(yǎng)，清洗去除未黏附的細(xì)菌后，采用甲醇固定，經(jīng)革蘭氏染色或吉姆薩染液染色，使用顯微鏡觀察并計(jì)算黏附率。③懸浮培養(yǎng)染色觀察計(jì)數(shù)。制備雞上皮細(xì)胞和豬上皮細(xì)胞，將等體積的菌懸液與其混勻，倒置顯微鏡下觀察細(xì)菌黏附情況。④黏蛋白模擬。將無(wú)菌聚丙烯管或微孔板用黏蛋白包被，加入待測(cè)菌，孵育、洗滌后，通過(guò)測(cè)定活菌數(shù)，計(jì)算黏附率。

1.2.4 對(duì)致病菌的抗菌活性分析

2002年，世界衛(wèi)生組織制訂的食品益生菌評(píng)價(jià)指南提出：益生菌代謝產(chǎn)物要有有效的抑菌活性[10]，益生菌對(duì)胃腸道固有病原菌的抑菌特性是一重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。銅綠假單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等是用于測(cè)定益生菌抑菌活性的病原指示菌。檢測(cè)方法概括有：①牛津杯法。將不同指示菌涂布于平板，并放置在牛津杯中，加待測(cè)菌的上清液，培養(yǎng)后，根據(jù)測(cè)定的抑菌圈直徑判斷抑菌活性。②雙層平板法。待測(cè)菌培養(yǎng)液點(diǎn)種于平板上培養(yǎng)，經(jīng)氯氣處理，將加有指示菌的軟瓊脂傾注于改良平板表面，培養(yǎng)后，測(cè)定抑菌圈直徑。③瓊脂擴(kuò)散法。將加有指示菌的軟瓊脂傾注于瓊脂平板上，在平板培養(yǎng)基上打孔，將待測(cè)菌上清液或菌泥重懸液加至孔中，培養(yǎng)48 h測(cè)定抑菌圈的大小。④點(diǎn)種法。在軟瓊脂培養(yǎng)基中加入指示菌液，將待測(cè)乳酸菌液點(diǎn)種于瓊脂平板（涂布指示菌）表面，培養(yǎng)后，測(cè)定抑菌圈直徑。⑤挖塊法。在平板培養(yǎng)基上涂布指示菌，將待測(cè)菌株在其相應(yīng)的平板上培養(yǎng)后，打孔，用牙簽挑取長(zhǎng)有待測(cè)菌的瓊脂塊點(diǎn)至瓊脂平板（涂布指示菌）上，培養(yǎng)測(cè)定抑菌圈直徑。⑥濾紙片法。在濾紙片上液加待測(cè)菌，置于瓊脂平板（涂布指示菌）上，培養(yǎng)測(cè)定抑菌圈直徑。

1.3 菌株的安全性評(píng)價(jià)

針對(duì)益生菌的不同特性，國(guó)內(nèi)外學(xué)者提出了多種益生菌菌株安全性評(píng)價(jià)方法。以下著重對(duì)糧農(nóng)組織（FAO）/世界衛(wèi)生組織（WHO）在2002年建立的安全性評(píng)估指導(dǎo)規(guī)則中推薦的益生菌安全測(cè)定實(shí)驗(yàn)進(jìn)行論述。

1.3.1 抗生素耐藥性譜測(cè)定

耐藥性是篩選益生菌的重要指標(biāo)之一，研究表明，抗性基因可以在食物和腸道環(huán)境中發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此，符合要求的益生菌應(yīng)同時(shí)具備：①無(wú)耐藥等有害基因。②不能通過(guò)遺傳修飾獲得有害基因。③不能具有將有害基因轉(zhuǎn)移的潛力。

1.3.2 溶血性測(cè)定

菌株是否有溶血性是篩選益生菌的先決條件。應(yīng)使用特異性免疫血清進(jìn)行定量凝集試驗(yàn)（凝集效價(jià)不低于原效價(jià)一半）。血平板培養(yǎng)是常見(jiàn)的溶血性的評(píng)價(jià)方法。①α-溶血：又稱(chēng)草綠色溶血，菌落周?chē)呐囵B(yǎng)基出現(xiàn)草綠色環(huán)。②β-溶血：菌落周?chē)纬山缦薹置?、完全透明的溶血環(huán)。③γ-溶血：菌落周?chē)呐囵B(yǎng)基沒(méi)有變化。

1.3.3 產(chǎn)毒能力測(cè)定

益生菌產(chǎn)毒能力也是影響安全性的重要因素。檢測(cè)的主要指標(biāo)是生物胺。通常采用的方法有：①表型檢測(cè)。有固體培養(yǎng)檢測(cè)和液體培養(yǎng)檢測(cè)，觀察培養(yǎng)基的顏色變化或者高效液相色譜定量測(cè)定培養(yǎng)結(jié)束后產(chǎn)生的生物胺。②基因檢測(cè)。對(duì)與生物胺產(chǎn)生有關(guān)的基因（如酪氨酸脫羧酶等）通過(guò)多重PCR的方法進(jìn)行檢測(cè)。綜上，結(jié)合表型檢測(cè)和多重PCR檢測(cè)，可以提高菌株產(chǎn)生物胺評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性。

1.3.4 毒力因子測(cè)定

通過(guò)檢測(cè)參與毒力因子形成的相關(guān)毒力基因可實(shí)現(xiàn)毒力因子的檢測(cè)。某些菌株會(huì)產(chǎn)生腸毒素、表面活性素、嘔吐毒素等物質(zhì)，需要測(cè)試毒素生產(chǎn)情況和安全性。

2 產(chǎn)品質(zhì)量控制

益生菌產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝復(fù)雜且技術(shù)含量高。因此，想要生產(chǎn)出高質(zhì)量的益生菌產(chǎn)品，必須使用通過(guò)有效性、安全性評(píng)價(jià)的菌種，采用的生產(chǎn)工藝必須科學(xué)穩(wěn)定。

2.1 物理性狀檢查

益生菌類(lèi)產(chǎn)品應(yīng)有均一的外觀和色澤，大小一致的顆粒，可有輕微的酸味、芳香味等，但不可有刺鼻異味。若益生菌類(lèi)產(chǎn)品散發(fā)出酸香味且沒(méi)有霉味，可初步判斷該產(chǎn)品中活菌數(shù)較充足，且霉菌量少，質(zhì)量較好。

2.2 含一定數(shù)量的有效微生物

益生菌的活菌數(shù)是益生菌類(lèi)產(chǎn)品重要的質(zhì)量指標(biāo)。為保證對(duì)原有腸道微生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響，必須保證進(jìn)入腸道的益生活菌數(shù)達(dá)到1×107～1×1010個(gè)/g（mL）?；罹鷶?shù)的檢測(cè)手段包括平板計(jì)數(shù)法、免疫法、顯色培養(yǎng)基法和生物化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法等。根據(jù)不同菌種的培養(yǎng)要求，選擇適宜條件和培養(yǎng)方法。

2.3 水分控制

益生菌類(lèi)產(chǎn)品中的水分含量是影響制劑質(zhì)量的重要指標(biāo)。若環(huán)境中水分含量較高，則益生菌代謝旺盛，養(yǎng)料消耗快，益生菌易死亡。故益生菌類(lèi)產(chǎn)品中水分含量要控制在3%以下。不同菌種的益生菌類(lèi)產(chǎn)品，其含水量要求也有差異。

2.4 衛(wèi)生指標(biāo)檢測(cè)

益生菌類(lèi)產(chǎn)品的衛(wèi)生指標(biāo)是指其中的有害微生物及有害物質(zhì)。必須嚴(yán)格控制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等致病性菌的污染，同時(shí)防止包括真菌毒素、重金屬等有害因素的污染。

2.5 產(chǎn)品保存期

益生菌類(lèi)產(chǎn)品保存期一般是指在一定保存條件下，能夠保持益生菌達(dá)到規(guī)定活菌數(shù)的最長(zhǎng)時(shí)間。不同益生菌產(chǎn)品的保存期和保存方式都不同。隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，益生菌類(lèi)產(chǎn)品活菌數(shù)逐漸減少?；罹鷮?duì)光、熱和潮濕較為敏感，真空厭氧包裝和冷藏可延長(zhǎng)益生菌類(lèi)產(chǎn)品保存期。

3 存在的問(wèn)題及其對(duì)策

3.1 菌種使用不規(guī)范

目前，我國(guó)的益生菌篩選工作存在很多問(wèn)題，如菌種來(lái)源不明、菌種生物特性不清、菌株信息不透明、生產(chǎn)缺乏規(guī)范性等。為了片面追求產(chǎn)品的高菌數(shù)含量，一些廠家采用多種菌共同作用，包括一些未經(jīng)批準(zhǔn)、安全性未知的菌種，導(dǎo)致益生菌產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，應(yīng)用效果不佳。甚至還有生產(chǎn)廠家盲目連續(xù)傳代菌種，導(dǎo)致菌種代次已嚴(yán)重超過(guò)其有效代次，還有些菌種遺傳穩(wěn)定性不明確，這些可能對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量及其臨床應(yīng)用效果帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)。

3.2 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚不健全

目前，缺乏益生菌的具體制造標(biāo)準(zhǔn)和檢驗(yàn)規(guī)程導(dǎo)致廠家生產(chǎn)工藝較隨意，質(zhì)量檢測(cè)不規(guī)范，造成益生菌產(chǎn)品品質(zhì)不穩(wěn)定，活菌含量低，缺乏有效活菌數(shù)，因而導(dǎo)致應(yīng)用效果無(wú)法保證。

充分評(píng)估益生菌的有效性和安全性是將新開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品商業(yè)化之前必不可少的。然而，現(xiàn)階段各國(guó)對(duì)益生菌的評(píng)價(jià)方法有所不同，也沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)益生菌的標(biāo)準(zhǔn)也鮮有建立，更沒(méi)有建立評(píng)價(jià)規(guī)程。

4 結(jié)語(yǔ)

為保證益生菌類(lèi)產(chǎn)品的品質(zhì)質(zhì)量，應(yīng)嚴(yán)格從菌種的選擇上保證其有效性，在生產(chǎn)工藝上嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)，同時(shí)保證可追溯性，擁有完善的質(zhì)量保證體系，能夠沿著供應(yīng)商原料采購(gòu)，工廠生產(chǎn)控制，成品運(yùn)輸這一整條線路進(jìn)行監(jiān)控和雙向追溯。同時(shí)，隨著對(duì)益生菌安全性評(píng)價(jià)方法和有效性評(píng)價(jià)方法研究的深入，迫切需要加快相關(guān)法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的制定，加強(qiáng)益生菌產(chǎn)業(yè)的規(guī)范管理和行業(yè)監(jiān)督管理，以保障產(chǎn)業(yè)持續(xù)、健康發(fā)展。

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