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    蝦干中AFB1毒素LC-MS/MS檢測(cè)方法的建立

    2019-10-21 08:41:06王小博鄭琳鄭培君
    現(xiàn)代食品·上 2019年8期
    關(guān)鍵詞:毒素

    王小博 鄭琳 鄭培君

    摘 要:通過對(duì)前處理方法及色譜、質(zhì)譜條件的優(yōu)化建立了蝦干中AFB1的LC-MS檢測(cè)方法。選用甲醇-水(含0.1%甲酸的5 mmol·L-1乙酸銨)為流動(dòng)相,ESI+掃描模式,乙腈/水(84/16)為提取溶液,提取時(shí)間60 min,提取溫度25 ℃,正己烷脫脂凈化。該條件下建立的蝦干中AFB1毒素檢測(cè)方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高。

    關(guān)鍵詞:AFB1;毒素;蝦干;LC-MS/MS

    Abstract:The LC-MS method for the determination of AFB1 in dried shrimp was established by optimizing the pretreatment method and the conditions of chromatography and mass spectrometry. Methanol-water (5 mmol·L-1 ammonium acetate containing 0.1% formic acid) was selected as mobile phase, ESI+ scanning mode, acetonitrile/water (84/16) as extraction solution, extraction time was 60 min, extraction temperature was 25 ℃, n-hexane degreasing and purification. Under this condition, the determination method of AFB1 toxin in dried shrimp is rapid, accurate and sensitive.

    Key words:AFB1; Mycotoxin; Dried shrimp; LC-MS/MS

    中圖分類號(hào):O657.63

    黃曲霉毒素是黃曲霉菌、寄生曲霉菌等產(chǎn)毒菌株產(chǎn)生的次生代謝物。在天然食物中黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)最易產(chǎn)生、存在最多、毒性最強(qiáng),具有高致癌性[1],已被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為Ⅰ類致癌物[2]。AFB1在自然環(huán)境中廣泛存在,其造成的農(nóng)作物、動(dòng)物飼料污染和病害時(shí)有發(fā)生[3]。魚、蝦等水產(chǎn)品攝食被AFB1污染的飼料后,可在體內(nèi)蓄積,同時(shí)水產(chǎn)品在加工制作、儲(chǔ)存過程中不易被消減,誤食被AFB1污染的水產(chǎn)制品會(huì)對(duì)人類的健康構(gòu)成巨大威脅。因此,為了保障水產(chǎn)品及消費(fèi)者安全,應(yīng)建立快速高效的水產(chǎn)制品中AFB1的檢測(cè)方法,從而加強(qiáng)對(duì)水產(chǎn)制品的監(jiān)測(cè)。然而,現(xiàn)有的針對(duì)水產(chǎn)制品中AFB1毒素的檢測(cè)方法還較為缺乏。LC-MS/MS檢測(cè)法靈敏性極高、檢測(cè)限極低,準(zhǔn)確性好,非常適合AFB1的痕量分析,近年來受到了大家的廣泛歡迎[4]。本研究以蝦干為研究對(duì)象,通過對(duì)色譜條件、質(zhì)譜條件、毒素提取方法的優(yōu)化,建立水產(chǎn)制品中AFB1毒素LC-MS/MS檢測(cè)方法,從而為水產(chǎn)品中AFB1的檢測(cè)提供了技術(shù)支撐。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    蝦干購(gòu)自佛山市市場(chǎng);AFB1標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%),Enzo,USA;甲醇(色譜純,≥99.9%)、乙腈(色譜純,≥99.9%)、乙酸銨、甲酸及乙酸乙酯,天津光復(fù)試劑有限公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

    TSQ Quantum Access液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國(guó)Thermo Scientific公司;渦旋震蕩儀,美國(guó)Scientific Industries;離心機(jī),艾本德;氮吹儀,上海安譜科學(xué)儀器有限公司;電子天平,上海英恒。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

    從濃度為10 μg·mL-1的AFB1母液中取1 mL于10 mL容量瓶中,用乙腈定容,獲得濃度為1 μg·mL-1的AFB1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。吸取適量AFB1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用純甲醇配成500 ng·mL-1的毒素標(biāo)準(zhǔn)液,然后根據(jù)需要用30%的甲醇溶液配制所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。

    1.3.2 色譜條件的建立

    色譜柱:Hypersil Gold(100 mm × 2.1 mm,5 μL);

    流動(dòng)相:甲醇-5 mmol·L-1乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)。進(jìn)樣體積:10.0 μL;進(jìn)樣速率:10.0 μL·s-1;采用梯度洗脫,梯度洗脫條件見表1。進(jìn)樣速率:250.0 μL·min-1。流動(dòng)相:A甲醇,B 5 mmol·L-1的乙酸銨溶液+0.1%的甲酸溶液。

    1.3.3 質(zhì)譜條件的建立

    對(duì)目標(biāo)化合物的質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化,最終選取二級(jí)質(zhì)譜中響應(yīng)較高的子離子進(jìn)行SRM的質(zhì)譜條件優(yōu)化。

    1.3.4 樣品處理

    蝦干剪碎后取2.00 g,置于50 mL離心管中,加入15 mL的乙腈/水(84/16)勻漿,渦旋振蕩10 min

    (2 000 r·min-1),超聲萃取10 min,離心5 min

    (7 500 r·min-1)后準(zhǔn)確移取上清液,重復(fù)3次,合并上清液[4];60 ℃下N2吹干,用1 mL30%的甲醇溶液(含5 mmol·L-1 CH3COONH4溶液∶0.1%甲酸=3∶7;V∶V)溶解,加入5 mL正己烷7 000 r·min-1離心

    5 min進(jìn)行脫脂,用一次性注射器取下層液過0.22 μm濾膜于進(jìn)樣小瓶中。

    1.3.5 方法學(xué)驗(yàn)證

    (1)線性??瞻讟悠分屑尤階FB1的標(biāo)準(zhǔn)溶液,AFB1的濃度范圍為0.5~100 ng·g-1。

    (2)準(zhǔn)確度和精密度。準(zhǔn)確度用AFB1的提取

    回收率表示,精密度用AFB1回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的百分?jǐn)?shù)表示(SD)??瞻讟悠分蟹謩e加入50、100、

    200 ng·mL-1 AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照1.3.4的方法處理后,上機(jī)檢測(cè),重復(fù)5次。

    (3)LOD與LOQ。最低檢出限(LOD)由3倍信噪比(S/N=3/1)得出,最低定量限(LOQ)由10倍信噪比得出(S/N=10/1)。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 液相色譜條件的選擇

    實(shí)驗(yàn)對(duì)比了Hypersil Gold-C18柱和Agilent TC-C18柱對(duì)AFB1的分離效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hypersil Gold-C18柱對(duì)AFB1的分離效果好于Agilent TC-C18柱,因此選擇Hypersil Gold-C18色譜柱。影響LC-MS/MS檢測(cè)方法靈敏度的因素除了目標(biāo)物自身的性質(zhì)外,還有流動(dòng)相的組成。本研究比較了甲醇-水、乙腈-水的分離效果和離子化效率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇與乙腈都能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的分離。在流動(dòng)相中加入適量的乙酸銨和甲酸能夠提高目標(biāo)物的離子化效率,同時(shí)可以有效改善峰形[5]。在流動(dòng)相中加入含0.1%甲酸的5 mmol·L-1乙酸銨、0.1%乙酸的5 mmol· L-1乙酸銨,結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入含0.1%甲酸的5 mmol·L-1的乙酸銨,可以明顯增加AFB1的響應(yīng)值。因此,最終確定流動(dòng)相為甲醇-水(含0.1%甲酸的5 mmol·L-1乙酸銨)。

    2.2 質(zhì)譜條件的選擇

    在正離子(ESI+)模式下對(duì)AFB1進(jìn)行全掃描分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)AFB1在ESI+模式下生成[M+H]+離子團(tuán),因此本實(shí)驗(yàn)采用ESI+監(jiān)測(cè)模式(表2)。AFB1的MRM圖如圖1。

    2.3 提取條件的優(yōu)化

    2.3.1 提取時(shí)間的優(yōu)化

    在25 ℃下,加標(biāo)量為20 μg·kg-1,選用乙腈/水(84/16)做為提取溶劑,改變提取時(shí)間(20、40、60、80 min及100 min),檢測(cè)計(jì)算毒素的回收率。由圖2可知,隨著提取時(shí)間的增加,當(dāng)提取時(shí)間為60 min時(shí),AFB1毒素的回收率最高。因此,提取時(shí)間選為60 min時(shí)。

    2.3.2 提取溫度的優(yōu)化

    選用乙腈/水(84/16)為提取溶劑,提取時(shí)間選為60 min,加標(biāo)量為20 μg·kg-1,改變提取溫度(5、15、25、35 ℃及45 ℃),檢測(cè)計(jì)算毒素的回收率。由圖3可知,當(dāng)提取溫度為25 ℃時(shí),AFB1的回收率達(dá)到最高。因此,提取溫度選取25 ℃。

    2.3.3 提取溶劑比例的優(yōu)化

    提取時(shí)間為60 min,提取溫度為25 ℃,加標(biāo)量為20 μg·kg-1,選用乙腈-水為提取溶劑,改變?nèi)軇┍壤?6/24,80/20,84/16,88/12及92/8),檢測(cè)并計(jì)算毒素的回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn):隨著乙腈比例的增加,AFB1毒素的回收率先上升后下降;當(dāng)乙腈/水為84/16時(shí),AFB1的回收率明顯提高(圖4)。因此,溶劑比例選為84/16。

    2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

    2.4.1 線性和檢測(cè)下限

    吸取適量的標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入空白樣品中,使空白樣品加標(biāo)量為0、0.5、1、10、50 ng·g-1及100 ng·g-1,參照1.3.4方法進(jìn)行前處理后上機(jī)測(cè)定。以AFB1濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn),線性相關(guān)系數(shù)R2為0.999 86,線性范圍良好,蝦干中AFB1的LOD值為0.1 μg·kg-1,LOQ值為0.5 μg·kg-1。

    2.4.2 回收率和精密度

    在空白樣品中分別添加濃度為1、50、100 μg·kg-1的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液。平行測(cè)定5次,計(jì)算各毒素的回收率和精密度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AFB1的回收率在84.36%~103.27%。

    AFB1的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.46%~8.03%。表明本方法用于蝦干中AFB1的提取具有良好的準(zhǔn)確度和精密度,符合實(shí)驗(yàn)需求。

    3 結(jié)論

    通過對(duì)前處理方法及色譜、質(zhì)譜條件的優(yōu)化建立了蝦干中AFB1的LC-MS檢測(cè)方法。選用甲醇-水(含0.1%甲酸的5 mmol·L-1乙酸銨)為流動(dòng)相,ESI+掃描模式,乙腈/水(84/16)為提取溶液,提取時(shí)間60 min,提取溫度25 ℃,正己烷脫脂凈化。該條件下建立的蝦干中AFB1毒素檢測(cè)方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高。

    參考文獻(xiàn):

    [1]伏春燕.玉米中三種真菌毒素檢測(cè)方法旳研究[D].泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.

    [2]莫新少.黃曲霉毒素B1暴露及控制的研究進(jìn)展[J].護(hù)士進(jìn)修雜志,2009,24(1):32-34.

    [3]Wang X C,Liu X D,Liu J C,et al. Contamination Level of T-2 and HT-2 Toxin in Cereal Crops fromAba Area in Sichuan Province, China[J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 2012,88(3):396-400.

    [4]王小博,施 琦,王雅玲,等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定3種水產(chǎn)品中的T-2毒素與HT-2毒素[J].食品科學(xué),2016,37(24):164-169.

    [5]韓 深,劉 螢,王佩葫,等.超高效液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法快速測(cè)定葡萄酒中8種真菌毒素[J].環(huán)境化學(xué),2013,32(7):1417-1421.

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