稻米中無機(jī)砷檢測(cè)關(guān)鍵因素研究及方法建立

周明慧 陳 曦 張潔瓊 伍燕湘 王松雪

(國家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院，北京 100037)

砷(As) 是自然界中普遍存在的非金屬元素，具有多種形態(tài)，砷在生物體內(nèi)的毒性大小與砷賦存的化學(xué)形態(tài)密切相關(guān)，其中，毒性較大的是無機(jī)砷(iAs)[1,2]，已被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)列為I級(jí)人類致癌物。大米是我國大部分地區(qū)，特別是南方居民一日三餐的主食來源，相比玉米和小麥等其他糧食作物，水稻因其特殊的生長環(huán)境具有更強(qiáng)的砷富集能力，研究顯示稻谷中砷主要以無機(jī)砷和二甲基砷的形態(tài)存在[3]，稻谷消費(fèi)已成為我國居民對(duì)無機(jī)砷最主要的暴露途徑[4,5]，因此我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)早在2005年就對(duì)稻米中無機(jī)砷進(jìn)行了限量要求，并于2017年制定了大米中無機(jī)砷國際限量標(biāo)準(zhǔn)[6]。鑒于暴露風(fēng)險(xiǎn)與監(jiān)管要求，大米中無機(jī)砷的快速精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)成為標(biāo)準(zhǔn)制定和方法研究的熱點(diǎn)。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)于稻米中砷形態(tài)的提取，一般采用加入溶劑并借助一些輔助手段來提取樣品中不同形態(tài)的砷，主要的提取試劑可以分為無機(jī)試劑、有機(jī)試劑和生化酶類[7-9]，常用的提取方法有微波消解、超聲提取、加熱提取和超聲探針提取等[10-13]。Zheng等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)提取劑中的甲醇有利于有機(jī)砷的提取，但會(huì)降低無機(jī)砷的萃取效率。生化酶類可以避免砷形態(tài)之間的轉(zhuǎn)化，同時(shí)降低共提取物的干擾，但是成本較高，操作復(fù)雜繁瑣，且有的水解酶不易得到。硝酸作為一種常用的無機(jī)提取劑，提取效率較高，目前稀酸加熱法廣泛應(yīng)用于食品中無機(jī)砷的提取，同時(shí)也是GB 5009.11—2014《食品中總砷及無機(jī)砷的測(cè)定》[15]中規(guī)定的稻米樣品無機(jī)砷測(cè)定的試樣提取方法。通過對(duì)不同樣品測(cè)試發(fā)現(xiàn)，使用稀酸加熱法對(duì)稻米樣品進(jìn)行前處理，樣品的粒徑、溫度以及加熱方法，均是影響提取效率的關(guān)鍵因素。另外，熱浸提法耗時(shí)長，易造成砷化合物形態(tài)的轉(zhuǎn)化和損失，而且過程中的振搖受人為因素影響大。為此，以實(shí)際大米樣品為研究對(duì)象，對(duì)稻米中無機(jī)砷的測(cè)定的關(guān)鍵影響因素進(jìn)行系統(tǒng)研究，并建立微波消解-LC-AFS聯(lián)用方法對(duì)稻米中無機(jī)砷進(jìn)行精準(zhǔn)檢測(cè)，為稻米中無機(jī)砷的提取效率和測(cè)定效率及精準(zhǔn)性以及大米中無機(jī)砷的快速精準(zhǔn)檢測(cè)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 儀器與試劑

BAS-100A型液相色譜-原子熒光聯(lián)用儀(配有砷空心陰極燈)；Mars微波消解儀；NOVA-2S單模微波消解儀；PRP-X100陰離子交換柱(250×4.1 mm，10 μm，配有保護(hù)柱)；H1650型臺(tái)式高速離心機(jī)；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)；DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；Mettler pH計(jì)。

砷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：GBW08666亞砷酸根溶液、GBW08667砷酸根溶液、GBW08668一甲基砷溶液、GBW08669二甲基砷溶液、磷酸二氫銨、磷酸氫二銨、氨水(色譜純)；硼氫化鉀、氫氧化鉀、硝酸、鹽酸(優(yōu)級(jí)純)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用0.15 mol/L HNO3溶液分別將4種砷形態(tài)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)多次稀釋配制質(zhì)量濃度分別為2、5、10、20和25 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.2.2 儀器條件

液相色譜條件：流動(dòng)相為15 mmol/L (NH4)2HPO4，pH=6.0；梯度流速為0～2 min：1 mL/min，2～6 min：0.7 mL/min，6-12 min：1 mL/min；進(jìn)樣量為100 μL。

原子熒光條件：負(fù)高壓：285V；砷燈總電流：80 mA；主電流/輔助電流：40/40；載流：15% HCl溶液；還原劑：2% KBH4+0.5%KOH溶液；載氣流速：500 mL/min；輔助氣流速：1 000 mL/min；原子化器溫度：200 ℃。

1.2.3 樣品前處理

稱取經(jīng)研磨后粒徑為0.38 mm的大米粉樣品0.5 g，置于聚四氟乙烯消解罐中，加入7.5 mL 0.15 mol/L HNO3溶液，微波消解程序如表1所示。待提取液冷卻至室溫后于8 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾后進(jìn)樣測(cè)定。

表1 微波消解輔助提取程序

2 結(jié)果與討論

2.1 大米中無機(jī)砷檢測(cè)的影響因素

2.1.1 樣品粒徑的控制

樣品粒徑?jīng)Q定其表面積大小，樣品與提取液的接觸面積越大，越有利于無機(jī)砷的提取[16]，可見樣品粒徑對(duì)于提取效率至關(guān)重要。以GB 5009.11—2014的提取方法對(duì)不同粒徑樣品進(jìn)行前處理，提取液的測(cè)試結(jié)果由圖1可見，不論是糙米還是大米，隨著樣品粒徑增大，無機(jī)砷的檢測(cè)結(jié)果逐漸降低，由此可知，該方法并不能對(duì)粒徑大于0.15 mm的樣品進(jìn)行有效提取，同樣的結(jié)果在對(duì)不同粒徑的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)試中也可進(jìn)一步被證明(表2)，粒徑較大的GBW(E)080684a可測(cè)砷形態(tài)的總和明顯低于總砷的定值。一般規(guī)格的研磨儀僅能將大米樣品粉碎至粒徑為0.25 mm，要將樣品粉碎至粒徑小于0.25 mm較難實(shí)現(xiàn)，所以，需要選擇更為高效的前處理方式。

圖1 樣品粒徑對(duì)無機(jī)砷檢測(cè)結(jié)果的影響

2.1.2 前處理方法的選擇

本研究采用粒徑為0.15 mm的大米粉樣品，分別考察了振蕩、超聲和微波等常見輔助提取方式對(duì)于稻米中不同砷形態(tài)提取效果的影響，結(jié)果如圖2所示。圖2中揭示的稻米樣品中存在的3種主要的砷形態(tài)中，AsⅢ最難被提取，同時(shí)進(jìn)一步說明尋找更為有效的提取方式的必要性。室溫條件下，振蕩0.5～2.5 h均不能有效地提取樣品中的AsⅢ。同時(shí)，在60 ℃條件下，超聲輔助提取2.5 h不能完全將樣品中的無機(jī)砷提取出來。而微波輔助提取可在短時(shí)間內(nèi)提取細(xì)粒徑的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的無機(jī)砷，相比其他方式具有明顯的優(yōu)勢(shì)，這也是國際上廣泛采用的無機(jī)砷測(cè)定樣品前處理方法[17-19]。

表2 GB 5009.11—2014方法對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的提取率

圖2 不同前處理方法對(duì)不同砷形態(tài)提取效率的影響

2.1.3 溫度對(duì)于提取的影響

提取溫度對(duì)于無機(jī)砷的精準(zhǔn)測(cè)定至關(guān)重要，既要完全提取稻米中的無機(jī)砷，又要保證樣品中的砷形態(tài)不發(fā)生改變。借助可精準(zhǔn)穩(wěn)定控溫的單模微波消解技術(shù)，考察標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品中的無機(jī)砷在不同提取溫度下的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖3所示。溫度在低于110 ℃時(shí)，圖3a中AsⅢ的提取效率上升較為明顯，溫度達(dá)到110 ℃后，提取率隨溫度升高呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)；而圖3b中AsV則隨溫度的提高沒有明顯變化，但可觀察到在高溫范圍內(nèi)有緩慢的下降趨勢(shì)，初步推論2種不同價(jià)態(tài)的無機(jī)砷在高溫下有微量的轉(zhuǎn)化[20]；圖3c則證實(shí)了該推斷，溫度達(dá)到110 ℃后，無機(jī)砷總量無明顯變化，并且不同砷形態(tài)加和與總砷定值或者測(cè)定結(jié)果一致，證實(shí)此溫度下無機(jī)砷被有效提取出來，由標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)試結(jié)果可知，無機(jī)砷并未向有機(jī)砷轉(zhuǎn)換，而實(shí)際樣品測(cè)試結(jié)果也顯示，有機(jī)砷形態(tài)也并未向無機(jī)砷形態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)換。

2.1.4 微波輔助提取升溫條件的影響

以測(cè)定的粗粒徑樣品中不同砷形態(tài)結(jié)果之和與總砷定值進(jìn)行對(duì)比，選擇微波輔助提取升溫方式，如圖4所示。采用110 ℃，30 min的非梯度升溫方式，樣品中總砷提取結(jié)果明顯低于定值，而采用如表1所示的梯度升溫方式進(jìn)行微波輔助提取，由于在低溫條件下，樣品可與提取試劑充分混合，提高了高溫環(huán)節(jié)的提取效率，可實(shí)現(xiàn)不同粒徑樣品中不同砷形態(tài)在30 min被完全提取。

圖4 升溫程序?qū)τ谔崛⌒实挠绊?/p>

2.1.5 提取液酸度對(duì)于測(cè)定的影響

GB 5009.11—2014中規(guī)定不同砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液以純水配制，本研究重復(fù)了該方法對(duì)于不同砷形態(tài)組分的完全分離，如圖5所示；而樣品中無機(jī)砷使用酸度較大的0.15 mol/L的HNO3溶液進(jìn)行提取，會(huì)對(duì)色譜柱內(nèi)環(huán)境pH產(chǎn)生影響，尤其是對(duì)于LC-AFS法[21,22]，由于進(jìn)樣量多達(dá)100 μL，影響更加明顯，而陰離子交換柱的分離效果受pH影響較大，從而導(dǎo)致AsⅢ和DMA無法完全分離，見圖6。

圖5 純水配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的砷形態(tài)分離譜圖(10 ng/mL)

圖6 0.15 mol/L HNO3溶液提取大米樣品的砷形態(tài)分離譜圖

為解決大米樣品提取液酸度對(duì)色譜分離帶來的影響，根據(jù)不同砷形態(tài)分離的需求調(diào)整國標(biāo)中恒定流速為1.2.2所述梯度流速，在保證AsⅢ和DMA能得到完全分離的情況下檢測(cè)時(shí)間不會(huì)延長過多，符合批量樣品檢測(cè)需求(圖7)。

圖7 10 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的梯度流速洗脫色譜圖(磷酸二氫銨)

2.1.6 流動(dòng)相的選擇

梯度流速下無機(jī)砷的測(cè)定需要14 min(圖7)，同時(shí)待測(cè)物AsV的峰面積響應(yīng)較低，為進(jìn)一步提升檢測(cè)效率和靈敏度，在相同的pH和梯度流速條件下，本研究優(yōu)化出15 mmol/L(NH4)2HPO4作為流動(dòng)相，縮短檢測(cè)時(shí)間至10 min且顯著增加了AsV的峰面積(圖8)。

圖8 10 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的梯度流速洗脫色譜圖(磷酸氫二銨)

2.2 方法學(xué)評(píng)價(jià)

基于對(duì)稻米中無機(jī)砷分析關(guān)鍵影響因素的分析和控制，優(yōu)化建立了微波輔助提取-LC-AFS測(cè)定大米中無機(jī)砷的方法。

2.2.1 線性方程和檢出限

以LC-AFS色譜峰信噪比S/N為3:1時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度計(jì)算方法檢出限，同時(shí)在2～25 μg/L范圍內(nèi)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)進(jìn)行考察。如表3所示，2種無機(jī)砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)系列線性關(guān)系良好，檢出限滿足檢測(cè)需求。

表3 線性關(guān)系和檢出限

2.2.2 準(zhǔn)確度和精密度

為了進(jìn)一步考察本方法的準(zhǔn)確性，采用不同粒徑的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及實(shí)際樣品進(jìn)行測(cè)定，如表4所示。所測(cè)樣品中不同砷形態(tài)結(jié)果加和與總砷的標(biāo)準(zhǔn)值全部一致。

表4 方法準(zhǔn)確度/mg/kg

選取GBW(E)080684a大米粉成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，平行測(cè)定6次，無機(jī)砷的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.25%，方法精密度良好。

3 結(jié)論

對(duì)稻米粒徑、提取溫度、提取方式以及液相分離條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了微波消解-液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用方法精準(zhǔn)快速測(cè)定稻米中的無機(jī)砷，從前處理和檢測(cè)兩個(gè)方面提高粗粒徑樣品中無機(jī)砷的檢測(cè)效率和檢測(cè)精準(zhǔn)性。AsШ和AsⅤ的方法檢出限分別為0.026和0.047 ng/mL，滿足GB 2762—2017《食品中污染物限量》中規(guī)定稻谷、糙米和大米中無機(jī)砷限量為0.2 mg/kg的要求，同時(shí)可快速并準(zhǔn)確分析待測(cè)樣品，適用于批量大米樣品無機(jī)砷的測(cè)定。