熒光標志技術與PCR 檢驗技術相結合在高危型人乳頭瘤病毒診斷中的應用研究

時秀云 于欣 馬蘇琳

人乳頭瘤病毒(human papilloma virus， HPV)是以人類為唯一宿主的一種DNA 病毒， 現在已經明確， HPV 與宮頸癌的發(fā)生高度相關［1］。據統(tǒng)計， 60%～70%的女性感染過HPV 病毒， 99.8%的宮頸癌患者中可以檢測到HPV， 而HPV 陰性者幾乎不會發(fā)生宮頸癌。有15 種與宮頸癌相關的高危型HPV，其中我國高危病毒種組有HPV16、18、58 等［2］。目前， 分子生物學技術是臨床檢測HPV 的主要方法。第二代雜交俘獲試驗(hybrid capture test-Ⅱ， HC-Ⅱ)為臨床近年來廣泛采用的檢查技術［3］。隨著分子醫(yī)學的不斷發(fā)展， PCR 檢驗技術開始逐漸廣泛應用于臨床中， 實時熒光定量PCR 檢測技術是將熒光標志技術與PCR 技術相結合， 在對HPV-DNA 的檢測中具有靈敏性高、特異性強等優(yōu)點［4］。本研究對實時熒光定量PCR 與HC-Ⅱ檢測在高危型HPV 中的診斷價值進行比較，以評價實時熒光定量PCR 檢驗在高危型HPV 診斷中的應用價值?，F報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取本院婦產科2016 年3 月～2019 年3 月收治的224 例高危型HPV 感染患者為研究對象， 年齡26～58 歲， 平均年齡(34.33±8.52)歲。且簽署知情同意書。

1. 2 方法 患者均分別進行實時熒光定量PCR 與HC-Ⅱ檢測。

1. 2. 1 實時熒光定量PCR 檢驗 ①收集宮頸脫落細胞標本：擴陰器暴露宮頸口， 用棉拭子將分泌物擦去， 將宮頸刷伸入宮頸口， 單向輕柔轉動4～5 周， 將其放入有保存液的洗脫管中， 旋緊管蓋， 做好標識， 將宮頸刷折斷， 刷頭留在管中。②提取HPV-DNA：將標本轉移到1.5 ml 微量離心管中，13000 r/min 離心10 min， 棄上清， 加50 μl 裂解液充分懸浮沉淀， 100℃加熱10 min， 13000 r/min 離心10 min， 保留上清待用。③PCR 擴增：50℃ 15 min， 95℃ 10 min， 進行40 個55～95℃循環(huán)， 加熱模板DNA 至95℃， 雙鏈DNA 解離成為單鏈。

④雜交與洗脫：PCR 產物加入雜交緩沖液中， 沸水浴變性10 min， 設定雜交儀的溫度， 于51℃雜交1 h， 51℃洗脫15 min。⑤顯色與結果判讀：POD 孵育， POD 洗滌， 配制顯色液， 顯色。

1. 2. 2 HC-Ⅱ檢測 采用Digene公司提供的HPV-DNA檢測試劑盒， 對細胞標本雙鏈解鏈處理， 后使用RNA 探針進行雜交， 生成的雜交體與特異性抗體相結合， 根據發(fā)光的強度與大小進行定量測定， 計算其含量。若HPV 負荷量≥1.0 pg/ml，可判定HPV 陽性。

1. 3 觀察指標 比較不同程度宮頸病變患者HPV 檢出情況比較；比較兩種檢測方法的HPV 陽性檢出率和符合率。

1. 4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。計數資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。一致性評估采用Kappa 檢驗, 以0.4＜Kappa 值≤1 為一致性好。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2. 1 不同程度宮頸病變患者HPV 檢出情況比較 224 例高危型HPV 感染患者中， 76 例患者存在不同程度的CIN， 其中CIN Ⅰ級41 例， CIN Ⅱ級23 例， CIN Ⅲ級12 例。72 例患者為鱗狀上皮病變和慢性宮頸炎；CIN 各期患者的實時熒光定量PCR HPV 檢出率與HC-Ⅱ HPV 檢出率比較， 差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；鱗狀上皮病變和慢性宮頸炎患者的實時熒光定量PCR HPV 檢出率為62.5%， 高于HC-Ⅱ的33.3%，差異具有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。見表 1。

2. 2 兩種檢測方法的HPV 陽性檢出率比較及一致性分析 實時熒光定量PCR 檢測的HPV 陽性檢出例數為169 例、檢出率為75.4%， HC-Ⅱ檢測的HPV 陽性檢出例數為141 例、檢出率為62.9%。實時熒光定量PCR 檢測的HPV 陽性檢出率高于HC-Ⅱ檢測， 差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=8.210， P＜0.05)。兩種檢測方法的符合率為83.0%(186/224)， 一致性檢驗結果顯示， 兩種檢測方法的Kappa 值為0.67， 提示雖然陽性檢出率存在差異， 但兩種檢測方法仍具有較高的一致性。見表2。

表1 不同程度宮頸病變患者HPV 檢出情況比較［n(%)］

表2 224 例患者采用兩種檢測方法的HPV 陽性檢出情況及符合情況(n, %)

3 討論

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一， 占女性生殖器官惡性腫瘤的50%以上， 嚴重威脅著婦女的健康。全世界每年大約有4 萬人患病， 中國新發(fā)病例約計13 萬， 是僅次于乳腺癌而引起婦女癌癥相關死亡的重要原因［5］。有研究證明， 99%的宮頸癌組織中可檢出HPV， 隨著病變程度的加重，HPV 的檢出率也逐漸增高， 因此目前已經明確HPV 感染為宮頸癌前病變和浸潤性宮頸癌發(fā)生的必要條件［6］。有研究表明， 高危型HPV 感染與宮頸癌關系最為密切。宮頸癌在發(fā)展過程中存在較長的、可逆轉的癌前病變期， 是唯一一種能夠通過醫(yī)學干預降低發(fā)病率和死亡率的惡性腫瘤［7］。如能進行HPV 早期檢測， 并在癌前病變階段進行阻斷性治療， 其治愈率可達98%， 而一旦疾病發(fā)展成癌癥并擴散至其他器官， 則其5 年存活率只有20%［8］。因此高危型HPV 的臨床診斷對于宮頸癌的預防和治療具有重要意義。研究發(fā)現， 造成宮頸癌及其癌前病變的高風險HPV 亞型共有14 種， 其中HPV16和HPV18 風險最高， 可導致70%～85%的宮頸癌病例［9］。通過宮頸病變及宮頸癌的篩查， 經分型檢測對患者個體化評估，預測宮頸病變發(fā)生的風險度， 來決定篩查時間的間隔及治療方案的制定。

由于HPV 至今尚不能在體外培養(yǎng)， 又無合適的實驗動物， 因而對其檢測主要依賴于分子生物學技術和形態(tài)學方法［3］。目前HPV 檢測方法主要包括有細胞學法、雜交捕獲法、PCR 法、Southern 雜交法、熒光原位雜交法、斑點印跡法等［10］。HC-Ⅱ系第二代雜交俘獲試驗， 相比于第一代雜交俘獲試驗(hybrid capture test-Ⅰ， HC-Ⅰ)， 將由原先的試管法改為96 孔平板法， 提高了工作效率， 降低了成本， 更適于大人群的篩查。該法同時能檢測13 種高危型HPV， 已得到世界范圍的認可［11］。Petry 等［12］對德國8466 例患者進行HC-Ⅱ檢測結果發(fā)現， HC-Ⅱ檢測CINⅡ級的敏感性97.8%高于常規(guī)細胞學的43.5%， 而且HC-Ⅱ檢測CIN Ⅱ級的特異性為95.3%， 陰性預測值為100.00%， 陽性預測值為10.9%， 基本吻合細胞學檢測。但HC 檢測也有一定的局限性：①不能區(qū)分HPV 具體型別；②如果所得相對光單位值接近或者＜1.0，則不能確定HPV 感染；③標本采集及保存有特殊的要求， 必須應用Digene 公司提供的專用器材及試劑， 或者應用液基細胞學剩余標本；④檢測結果陰性并不能排除HPV 感染， 因為可能存在病毒感染水平很低或者采樣不正確導致的假陰性；⑤HC-Ⅱ存在交叉雜交的問題， 即與不在混合探針中的其他HPV 型起交叉反應引起假陽性結果而降低特異性。

目前HPV 最靈敏的檢測方法是以基因擴增為基礎檢測HPV-DNA， 可檢測出低水平的病毒感染， 并且能夠比較準確地檢測出HPV 感染狀態(tài)， 因此成為流行病學和實驗室研究的常用方法［13］。實時熒光定量PCR 技術是一種新型核酸定量檢測方法， 是由美國Perkin Flmer 公司于1995 年研制成功的，是在DNA 擴增反應中， 以熒光化學物質測每次PCR 循環(huán)后產物總量的方法。其檢測原理為將標記有熒光素的Taqman探針與模板DNA 混合后， 完成高溫變性， 低溫復性， 適溫延伸的熱循環(huán)， 并遵守聚合酶鏈反應規(guī)律， 與模板DNA 互補配對的Taqman 探針被切斷， 熒光素游離于反應體系中， 在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光， 隨著循環(huán)次數的增加， 被擴增的目的基因片段呈指數規(guī)律增長， 通過實時檢測與之對應的隨擴增而變化熒光信號強度， 求得Ct 值， 同時利用數個已知模板濃度的標準品作對照， 即可得出待測標本目的基因的拷貝數。該法將普通PCR 的高靈敏性、DNA 雜交的高特異性和光譜技術的高精確性有機結合， 克服了傳統(tǒng)PCR 在許多方面的缺點和局限性。由于熒光探針的引入， 而且被釋放的熒光基團數目與PCR 產物數量相同， 使得該方法對DNA 模板定量的準確性與特異性都有很大提高。常用的PCR 擴增儀與傳統(tǒng)PCR 擴增儀相比， 應用更廣泛、檢測效率高、定量測量、結果重復性好、無管道內污染、擴增產物無需電泳分析等特點。熒光 PCR 檢測差異性微小， 檢驗結果的相關性較為良好。

本研究結果顯示：224 例高危型HPV 感染患者中， 76 例患者存在不同程度的CIN， 其中CIN Ⅰ級41 例， CIN Ⅱ級23 例， CIN Ⅲ級12 例；72 例患者為鱗狀上皮病變和慢性宮頸炎。CIN 各期患者的實時熒光定量PCR HPV 檢出率與HC-Ⅱ HPV 檢出率比較， 差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；鱗狀上皮病變和慢性宮頸炎患者的實時熒光定量PCR HPV檢出率為62.5%， 高于HC-Ⅱ的33.3%， 差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。實時熒光定量PCR 檢測的HPV 陽性檢出率為75.4%， HC-Ⅱ檢測的HPV 陽性檢出率為62.9%， 實時熒光定量PCR 檢測的HPV 陽性檢出率高于HC-Ⅱ檢測， 差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=8.210， P＜0.05)。兩種檢測方法的符合率為83.0%(186/224)， 一致性檢驗結果顯示， 兩種檢測方法的Kappa值為0.67， 提示雖然陽性檢出率存在差異， 但兩種檢測方法仍具有較高的一致性。提示實時熒光定量PCR 檢測技術檢測HPV 相比于HC-Ⅱ檢測具有更高的準確度。

綜上所述， 實時熒光定量PCR 檢測高危型HPV 具有較高的敏感性和特異性， 診斷價值高， 在實驗條件允許的情況下， 可做為首選的HPV 檢驗方法加以推廣和應用。