熒光標志技術(shù)與PCR 檢驗技術(shù)相結(jié)合在高危型人乳頭瘤病毒診斷中的應(yīng)用研究

時秀云 于欣 馬蘇琳

人乳頭瘤病毒(human papilloma virus， HPV)是以人類為唯一宿主的一種DNA 病毒， 現(xiàn)在已經(jīng)明確， HPV 與宮頸癌的發(fā)生高度相關(guān)［1］。據(jù)統(tǒng)計， 60%～70%的女性感染過HPV 病毒， 99.8%的宮頸癌患者中可以檢測到HPV， 而HPV 陰性者幾乎不會發(fā)生宮頸癌。有15 種與宮頸癌相關(guān)的高危型HPV，其中我國高危病毒種組有HPV16、18、58 等［2］。目前， 分子生物學(xué)技術(shù)是臨床檢測HPV 的主要方法。第二代雜交俘獲試驗(hybrid capture test-Ⅱ， HC-Ⅱ)為臨床近年來廣泛采用的檢查技術(shù)［3］。隨著分子醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展， PCR 檢驗技術(shù)開始逐漸廣泛應(yīng)用于臨床中， 實時熒光定量PCR 檢測技術(shù)是將熒光標志技術(shù)與PCR 技術(shù)相結(jié)合， 在對HPV-DNA 的檢測中具有靈敏性高、特異性強等優(yōu)點［4］。本研究對實時熒光定量PCR 與HC-Ⅱ檢測在高危型HPV 中的診斷價值進行比較，以評價實時熒光定量PCR 檢驗在高危型HPV 診斷中的應(yīng)用價值?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取本院婦產(chǎn)科2016 年3 月～2019 年3 月收治的224 例高危型HPV 感染患者為研究對象， 年齡26～58 歲， 平均年齡(34.33±8.52)歲。且簽署知情同意書。

1. 2 方法 患者均分別進行實時熒光定量PCR 與HC-Ⅱ檢測。

1. 2. 1 實時熒光定量PCR 檢驗 ①收集宮頸脫落細胞標本：擴陰器暴露宮頸口， 用棉拭子將分泌物擦去， 將宮頸刷伸入宮頸口， 單向輕柔轉(zhuǎn)動4～5 周， 將其放入有保存液的洗脫管中， 旋緊管蓋， 做好標識， 將宮頸刷折斷， 刷頭留在管中。②提取HPV-DNA：將標本轉(zhuǎn)移到1.5 ml 微量離心管中，13000 r/min 離心10 min， 棄上清， 加50 μl 裂解液充分懸浮沉淀， 100℃加熱10 min， 13000 r/min 離心10 min， 保留上清待用。③PCR 擴增：50℃ 15 min， 95℃ 10 min， 進行40 個55～95℃循環(huán)， 加熱模板DNA 至95℃， 雙鏈DNA 解離成為單鏈。

④雜交與洗脫：PCR 產(chǎn)物加入雜交緩沖液中， 沸水浴變性10 min， 設(shè)定雜交儀的溫度， 于51℃雜交1 h， 51℃洗脫15 min。⑤顯色與結(jié)果判讀：POD 孵育， POD 洗滌， 配制顯色液， 顯色。

1. 2. 2 HC-Ⅱ檢測 采用Digene公司提供的HPV-DNA檢測試劑盒， 對細胞標本雙鏈解鏈處理， 后使用RNA 探針進行雜交， 生成的雜交體與特異性抗體相結(jié)合， 根據(jù)發(fā)光的強度與大小進行定量測定， 計算其含量。若HPV 負荷量≥1.0 pg/ml，可判定HPV 陽性。

1. 3 觀察指標 比較不同程度宮頸病變患者HPV 檢出情況比較；比較兩種檢測方法的HPV 陽性檢出率和符合率。

1. 4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。一致性評估采用Kappa 檢驗, 以0.4＜Kappa 值≤1 為一致性好。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 不同程度宮頸病變患者HPV 檢出情況比較 224 例高危型HPV 感染患者中， 76 例患者存在不同程度的CIN， 其中CIN Ⅰ級41 例， CIN Ⅱ級23 例， CIN Ⅲ級12 例。72 例患者為鱗狀上皮病變和慢性宮頸炎；CIN 各期患者的實時熒光定量PCR HPV 檢出率與HC-Ⅱ HPV 檢出率比較， 差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；鱗狀上皮病變和慢性宮頸炎患者的實時熒光定量PCR HPV 檢出率為62.5%， 高于HC-Ⅱ的33.3%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。見表 1。

2. 2 兩種檢測方法的HPV 陽性檢出率比較及一致性分析 實時熒光定量PCR 檢測的HPV 陽性檢出例數(shù)為169 例、檢出率為75.4%， HC-Ⅱ檢測的HPV 陽性檢出例數(shù)為141 例、檢出率為62.9%。實時熒光定量PCR 檢測的HPV 陽性檢出率高于HC-Ⅱ檢測， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.210， P＜0.05)。兩種檢測方法的符合率為83.0%(186/224)， 一致性檢驗結(jié)果顯示， 兩種檢測方法的Kappa 值為0.67， 提示雖然陽性檢出率存在差異， 但兩種檢測方法仍具有較高的一致性。見表2。

表1 不同程度宮頸病變患者HPV 檢出情況比較［n(%)］

表2 224 例患者采用兩種檢測方法的HPV 陽性檢出情況及符合情況(n, %)

3 討論

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一， 占女性生殖器官惡性腫瘤的50%以上， 嚴重威脅著婦女的健康。全世界每年大約有4 萬人患病， 中國新發(fā)病例約計13 萬， 是僅次于乳腺癌而引起婦女癌癥相關(guān)死亡的重要原因［5］。有研究證明， 99%的宮頸癌組織中可檢出HPV， 隨著病變程度的加重，HPV 的檢出率也逐漸增高， 因此目前已經(jīng)明確HPV 感染為宮頸癌前病變和浸潤性宮頸癌發(fā)生的必要條件［6］。有研究表明， 高危型HPV 感染與宮頸癌關(guān)系最為密切。宮頸癌在發(fā)展過程中存在較長的、可逆轉(zhuǎn)的癌前病變期， 是唯一一種能夠通過醫(yī)學(xué)干預(yù)降低發(fā)病率和死亡率的惡性腫瘤［7］。如能進行HPV 早期檢測， 并在癌前病變階段進行阻斷性治療， 其治愈率可達98%， 而一旦疾病發(fā)展成癌癥并擴散至其他器官， 則其5 年存活率只有20%［8］。因此高危型HPV 的臨床診斷對于宮頸癌的預(yù)防和治療具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)， 造成宮頸癌及其癌前病變的高風險HPV 亞型共有14 種， 其中HPV16和HPV18 風險最高， 可導(dǎo)致70%～85%的宮頸癌病例［9］。通過宮頸病變及宮頸癌的篩查， 經(jīng)分型檢測對患者個體化評估，預(yù)測宮頸病變發(fā)生的風險度， 來決定篩查時間的間隔及治療方案的制定。

由于HPV 至今尚不能在體外培養(yǎng)， 又無合適的實驗動物， 因而對其檢測主要依賴于分子生物學(xué)技術(shù)和形態(tài)學(xué)方法［3］。目前HPV 檢測方法主要包括有細胞學(xué)法、雜交捕獲法、PCR 法、Southern 雜交法、熒光原位雜交法、斑點印跡法等［10］。HC-Ⅱ系第二代雜交俘獲試驗， 相比于第一代雜交俘獲試驗(hybrid capture test-Ⅰ， HC-Ⅰ)， 將由原先的試管法改為96 孔平板法， 提高了工作效率， 降低了成本， 更適于大人群的篩查。該法同時能檢測13 種高危型HPV， 已得到世界范圍的認可［11］。Petry 等［12］對德國8466 例患者進行HC-Ⅱ檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)， HC-Ⅱ檢測CINⅡ級的敏感性97.8%高于常規(guī)細胞學(xué)的43.5%， 而且HC-Ⅱ檢測CIN Ⅱ級的特異性為95.3%， 陰性預(yù)測值為100.00%， 陽性預(yù)測值為10.9%， 基本吻合細胞學(xué)檢測。但HC 檢測也有一定的局限性：①不能區(qū)分HPV 具體型別；②如果所得相對光單位值接近或者＜1.0，則不能確定HPV 感染；③標本采集及保存有特殊的要求， 必須應(yīng)用Digene 公司提供的專用器材及試劑， 或者應(yīng)用液基細胞學(xué)剩余標本；④檢測結(jié)果陰性并不能排除HPV 感染， 因為可能存在病毒感染水平很低或者采樣不正確導(dǎo)致的假陰性；⑤HC-Ⅱ存在交叉雜交的問題， 即與不在混合探針中的其他HPV 型起交叉反應(yīng)引起假陽性結(jié)果而降低特異性。

目前HPV 最靈敏的檢測方法是以基因擴增為基礎(chǔ)檢測HPV-DNA， 可檢測出低水平的病毒感染， 并且能夠比較準確地檢測出HPV 感染狀態(tài)， 因此成為流行病學(xué)和實驗室研究的常用方法［13］。實時熒光定量PCR 技術(shù)是一種新型核酸定量檢測方法， 是由美國Perkin Flmer 公司于1995 年研制成功的，是在DNA 擴增反應(yīng)中， 以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次PCR 循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。其檢測原理為將標記有熒光素的Taqman探針與模板DNA 混合后， 完成高溫變性， 低溫復(fù)性， 適溫延伸的熱循環(huán)， 并遵守聚合酶鏈反應(yīng)規(guī)律， 與模板DNA 互補配對的Taqman 探針被切斷， 熒光素游離于反應(yīng)體系中， 在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光， 隨著循環(huán)次數(shù)的增加， 被擴增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長， 通過實時檢測與之對應(yīng)的隨擴增而變化熒光信號強度， 求得Ct 值， 同時利用數(shù)個已知模板濃度的標準品作對照， 即可得出待測標本目的基因的拷貝數(shù)。該法將普通PCR 的高靈敏性、DNA 雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確性有機結(jié)合， 克服了傳統(tǒng)PCR 在許多方面的缺點和局限性。由于熒光探針的引入， 而且被釋放的熒光基團數(shù)目與PCR 產(chǎn)物數(shù)量相同， 使得該方法對DNA 模板定量的準確性與特異性都有很大提高。常用的PCR 擴增儀與傳統(tǒng)PCR 擴增儀相比， 應(yīng)用更廣泛、檢測效率高、定量測量、結(jié)果重復(fù)性好、無管道內(nèi)污染、擴增產(chǎn)物無需電泳分析等特點。熒光 PCR 檢測差異性微小， 檢驗結(jié)果的相關(guān)性較為良好。

本研究結(jié)果顯示：224 例高危型HPV 感染患者中， 76 例患者存在不同程度的CIN， 其中CIN Ⅰ級41 例， CIN Ⅱ級23 例， CIN Ⅲ級12 例；72 例患者為鱗狀上皮病變和慢性宮頸炎。CIN 各期患者的實時熒光定量PCR HPV 檢出率與HC-Ⅱ HPV 檢出率比較， 差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；鱗狀上皮病變和慢性宮頸炎患者的實時熒光定量PCR HPV檢出率為62.5%， 高于HC-Ⅱ的33.3%， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。實時熒光定量PCR 檢測的HPV 陽性檢出率為75.4%， HC-Ⅱ檢測的HPV 陽性檢出率為62.9%， 實時熒光定量PCR 檢測的HPV 陽性檢出率高于HC-Ⅱ檢測， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.210， P＜0.05)。兩種檢測方法的符合率為83.0%(186/224)， 一致性檢驗結(jié)果顯示， 兩種檢測方法的Kappa值為0.67， 提示雖然陽性檢出率存在差異， 但兩種檢測方法仍具有較高的一致性。提示實時熒光定量PCR 檢測技術(shù)檢測HPV 相比于HC-Ⅱ檢測具有更高的準確度。

綜上所述， 實時熒光定量PCR 檢測高危型HPV 具有較高的敏感性和特異性， 診斷價值高， 在實驗條件允許的情況下， 可做為首選的HPV 檢驗方法加以推廣和應(yīng)用。