不確定度評定在金銀花配方顆粒中綠原酸含量測定中的應用

★ 朱敏 魏慧珍 李新南 呂尚 鄢星 林苗苗 張曉男 饒毅** (.江西中醫(yī)藥大學 南昌 0004；.中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心 南昌 0006；.金日制藥(中國)有限公司 福建 廈門 600)

測定不確定度評估作為一種科學的驗證手段及質量控制方法，將增修于2020版的《中國藥典》。測量不確定度是表征合理地賦予被測量值的分散性，是與測量結果相關聯(lián)的參數(shù)[1]。測量的不確定度越小，說明測量水平越高，測量結果使用價值越高。

中藥配方顆粒是由單位中藥飲片經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒而成，具有免煎易服、起效快、攜帶方面，安全衛(wèi)生等優(yōu)點[2-3]。由于中藥配方顆粒經(jīng)一系列現(xiàn)代制備工藝加工制成后，在性狀和顯微鑒別上已經(jīng)完全不同于原藥材，因此，制定科學有效、重現(xiàn)性好的質量控制方法對中藥配方顆粒具有重大意義。金銀花配方顆粒的不確定度評定方面國內尚未有報道[4]。本文主要對HPLC測定金銀花配方顆粒中綠原酸的含量進行了不確定度探討，該研究結果可為配方顆粒中測定結果的準確性提供了科學依據(jù)。

1 材料

材料、試劑與儀器：SHIMADZU LC-20AD高效液相色譜儀(LC-20AD泵，SPD-M20A檢測器)， 梅特勒AB-104N萬分之一電子天平，SHIMADZU AUW220D十萬分之一電子分析天平，Milli-Q超純水機(美國Millipore公司)

綠原酸對照品(批號110753，純度為96.2%)，購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，金銀花配方顆粒(自制，每克配方顆粒相當于2g飲片)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱 Diamonsil C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：乙腈-0.2%磷酸溶液(12∶88，V/V)；檢測波長：327nm，流速：1.0mL/min，柱溫：30℃，進樣量：10μL。

2.2 對照品溶液的制備 取綠原酸對照品約10mg，精密稱定，置10mL量瓶中，加50%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1mL，置25mL量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為39.1μg/mL的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末(研磨后)約0.1g，精密稱取，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇25mL，稱定重量，超聲處理(功率250W，頻率35kHz)20min，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液2mL置10mL量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，搖勻即得。

2.4 方法學考察 精密度試驗 取上述對照品溶液，連續(xù)進樣6次，結果RSD值均在2%以內，表明儀器的精密度良好。

重復性試驗 按“2.3”項下方法平行制備六份供試品溶液，進樣測定，RSD值為1.49%表明該方法的重現(xiàn)性良好。

溶液穩(wěn)定性試驗 按“2.3”項下方法制備供試品溶液，制樣后0、2、4、8、12、24h進樣分析，RSD值為1.59%，表明該溶液在24h內溶液基本穩(wěn)定。

線性試驗 分別配制5份不同濃度綠原酸對照品溶液，測定峰面積，以濃度為(X)為橫坐標，峰面積為(Y)為縱坐標，計算回歸方程，結果顯示回歸方程Y= 31222564.49X-59431.08(r=0.9999)，表明綠原酸在133.7μg/mL～6.7μg/mL范圍內具有良好的線性關系。

加樣回收試驗 取已知含量金銀花配方顆粒的樣品6份，按100%加入的量各分別加入綠原酸對照品溶液10mL(濃度：174.0μg/mL)，按“2.3”項下方法制備，計算回收率，結果見表1，平均回收率為99.98%(RSD=1.10%)，說明該方法的準確性良好。

表1 加樣回收率試驗結果

2.5 不確定度分析[5-8]

2.5.1 不確定度的評估 依據(jù)《測量不確定度評定與表示》(JJF1059.1-2012)進行不確定度計算，采用數(shù)學模型Y=f(m、Vs、C0、As、Ai) ，式中：Y為試樣中綠原酸的質量分數(shù)；m為樣品質量；Vs為樣品定容體積；C0為標準溶液；As為標準品峰面積；Ai為樣品峰面積。

2.5.2 不確定度的來源 含量測定步驟中的每一個因素都會對測定結果產(chǎn)生影響， 因此都是不確度的來源，將其繪制成因果圖，見圖1。

2.5.2.1 制備樣品引入的不確定度u(M) 樣品制備引入不確定度u(M)由稱量u(m)和定容u(Vs)過程引入的不確定度組成。

圖1 不確定度來源因果圖

(1)樣品稱量引入的不確定度u(m)

式中：a為鑒定證書其最大允許誤差；k為分布形態(tài)。

(2)樣品定容體積引入的不確定度u(Vs)

1)2mL單標線吸量管引入的不確定：

②由于移液管測量重復性產(chǎn)生的不確定度:通過10次測定，計算得u(Vs12)=0.0093 mL；

③溫度：由于本試驗溫度與校準溫度相同，所以此項可忽略。

2)10mL單標線量瓶引入的不確定度：

② 由于量瓶測量重復性產(chǎn)生的不確定度:重復測定10次，測得u(Vs22)=0.0073mL；

③ 溫度：由于本試驗溫度與校準溫度相同,此項可忽略。

因此配制樣品的合成標準相對不確定度為：

3)樣品峰面積引入的不確定度Ai：

供試品溶液連續(xù)進樣4次，結果分別為：864103、853029、854320、859993，按貝塞爾公式:

2.5.2.2 對照品溶液引入的不確定度u(C) 對照品溶液引入不確定度u(C)由對照品的不確定度u(Cn)和對照品溶液配制過程引入的不確定度u(CP)組成。

(1)對照品的不確定度

綠原酸對照品證書提供的質量分數(shù)為94.9%，未給出限度標識，故此項不考慮。

(2)對照品溶液配制過程引入的不確定度

對照品溶液儲備液：精密稱取約10.00mg對照品固體，置10.00mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1.00mg/mL的對照品儲備液。

對照品使用液配制：取1.00mL 1.00mg/mL的對照品儲備液稀釋至25mL，配成約39.1μg/mL的對照品溶液。

1)1mL移液管u(V移液管)：

② 由于移液管測量重復性產(chǎn)生的不確定度：通過10次測定，計算得u(Vs12)=0.0065 mL；

③ 溫度：由于本試驗溫度與校準溫度相同，所以此項可忽略。

2) 25mL單標線容量瓶u(V量瓶)：

② 由于量瓶測量重復性產(chǎn)生的不確定度：重復測定10次,測得u(Vs22)=0.0031mL;

(3)稱量帶入的不確定度：

用分析天平稱取10.00mg，精確到0.01mg，實際操作中采用精度為0. 01mg的電子天平稱量，根據(jù)檢定證書其最大允許誤差為±0.001mg，由于本試驗稱量過程中控溫，即溫度變化較小，所以此項可忽略。樣品稱量是由一次歸零稱量所得，且使用的是自動顯示數(shù)字的天平。

(4)對照品峰面積引入的不確定度As：

對照品溶液連續(xù)進樣6次，結果如下：1136915、1148449、1142350、1142385、1146959、1140106，按貝塞爾公式:

2.5.3 計算合成不確定度及擴展不確定度 將不確定度的來源進行分別計算，再將其帶入公式(1)可知，綠原酸的合成不確定度為：

由實驗數(shù)據(jù)計算得金銀花配方顆粒中綠原酸含量的最佳估計(X)=29.49mg/g，所以綠原酸的擴展不確定度u=29.49 mg/g×2.70%=0.80mg/g。

2.5.4 報告測定不確定度 經(jīng)過不確定度分析可知，金銀花配方顆粒中綠原酸的測量結果為(29.49±0.80)mg/g。

3 結果與討論

由于中藥配方顆粒在制備過程中有效成分已被煎煮出來，因此制備供試品溶液時采用超聲溶解即可?？疾炝瞬煌瑵舛热軇⒉煌晻r間的因素，綜合考慮，選取50%乙醇、20min時間制備供試品溶液，試驗結果表明，該方法操作簡便、精密度、重現(xiàn)性良好。

分析評估不確定度時，應盡量考慮到產(chǎn)生不確定度的所有來源，因為合成不確定度的數(shù)值幾乎完全取決于重要的不確定度分量。根據(jù)上述評定可得，本方法測量綠原酸結果的各分量不確定度均較小，測量綠原酸結果的不確定度主要來自于對照品和樣品的峰面積的不確定度、稀釋對照品帶來的不確定度，結果見表2。

由表2可知稀釋對不確定度的貢獻最大且不確定度會隨著稀釋次數(shù)而累積，因此在含量測定的過程中，降低不確定度的主要途徑首先是直接將對照品稱量置250mL量瓶中和樣品直接置250mL量瓶中；其次，盡量使用容量大的玻璃量具也是降低配制過程中不確定度的有效方法。在分析了以上影響測量不確定度的原因后，若采取相應的措施,可將測量結果的不確定度進一步減小。

表2 綠原酸不確定度分量