MMP-9和TIMP-1在各期大鼠壓力性損傷模型中的表達(dá)及意義

張亞楠 李賢

(承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

已有研究顯示壓力性損傷在德國(guó)院外發(fā)生率為21%，院內(nèi)發(fā)生率為0.78%〔1〕；我國(guó)調(diào)查發(fā)現(xiàn)院內(nèi)壓力性損傷發(fā)生率為0.628%〔2〕。研究表明〔3，4〕，壓力性潰瘍的形成與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和MMP組織抑制劑(TIMP)因子之間失去平衡有關(guān)。研究表明大鼠5個(gè)缺血循環(huán)再灌注的損傷組織中比3個(gè)缺血循環(huán)再灌注的損傷組織中MMP-9的表達(dá)升高〔5〕。本文擬觀察MMP-9和TIMP-1在各期大鼠壓力性損傷模型中的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 64只健康雄性大鼠購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重(380±20)g，動(dòng)物合格證編號(hào)為1607106。

1.2實(shí)驗(yàn)器材、試劑 圓片形鐵片(直徑15 mm,厚0.3 mm,重0.6 g，高壓滅菌消毒)、 圓形磁鐵(直徑15 mm,厚5.0 mm,重2.6 g，磁通量高達(dá)1500高斯)購(gòu)自河北超強(qiáng)磁業(yè)技術(shù)有限公司。抗體MMP-9(PAA553Ra01)抗體TIMP-1(PAA552Ra01)購(gòu)自美國(guó)Cloud-Clone公司。

1.3動(dòng)物分組 健康雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w,按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為空白組、對(duì)照組、1期壓力性損傷組(1期組)、2期壓力性損傷組(2期組)、可疑深部組織損傷組(可疑組)、3期壓力性損傷組(3期組)、不可分期組、4期壓力性損傷組(4期組)各 8只。

1.4壓力性損傷模型的復(fù)制 參照文獻(xiàn)〔6，7〕，利用缺血循環(huán)再灌注的方法復(fù)制各期壓力性損傷模型。首先禁食水8 h，用10%的水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，用配置好的脫毛劑(8 g硫化鈉+20 ml酒精+80 ml水)進(jìn)行臀部脫毛，然后用安爾碘進(jìn)行臀部消毒，在左臀部靠近頭端剪2 cm×2 cm的切口，用無(wú)菌鉗子和鑷子鈍性分離臀部肌肉，最后將鐵片放到肌肉下，通過(guò)筋膜固定鐵片，縫合切口。讓大鼠帶鐵片適應(yīng)性生活3 d,沒有感染現(xiàn)象的在體外加壓磁鐵2 h，拿下磁鐵讓局部組織充血循環(huán)再灌注0.5 h，每天5個(gè)循環(huán)，直到復(fù)制出各期壓力性損傷模型。8組同一時(shí)間植入鐵片，采取先復(fù)制4期壓力性損傷模型，再?gòu)?fù)制不可分期，以此類推，使4期2個(gè)階段的壓力性損傷模型在同一時(shí)間復(fù)制完成，最后在同一時(shí)間殺死8組大鼠，保證了鐵片在每組中植入的時(shí)間相同，降低鐵片對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

1.5組織學(xué)觀察 各期壓力性損傷組織通過(guò)蘇木素-伊紅(HE)染色觀察病理學(xué)變化，采用免疫組化法測(cè)定各期壓力性損傷中的MMP-9和TIMP-1水平，其中一抗用1∶200的比例進(jìn)行稀釋。光鏡觀察，結(jié)果以胞質(zhì)或胞膜著棕色為陽(yáng)性染色。在400倍光鏡下觀察免疫組化結(jié)果，在光鏡下每組取3張片子，每張片子隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并以百分?jǐn)?shù)表示，分別測(cè)定MMP-9和TIMP-1陽(yáng)性表達(dá)率，取其均值并計(jì)算MMP-9/TIMP-1的比值。

1.6成膜判斷標(biāo)準(zhǔn) 1期：皮膚完整，表面有不褪色的壓紅；病理學(xué)表皮鱗狀細(xì)胞缺失，病灶部位有少量中性粒細(xì)胞。2期：皮膚紅腫，呈現(xiàn)暗紅色，無(wú)流血流膿；病理學(xué)表皮大部分缺失，淺部真皮層有淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)?？梢缮畈拷M織損傷期：受壓部皮膚顏色變紫色或黑色,周圍紅腫加重,按壓周圍紅腫處皮膚流出少量淡黃色組織液；病理學(xué)表皮大部分缺失,真皮層有潰瘍產(chǎn)生且伴有多量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。3期：受壓處皮膚變黑變硬,針刺不出血,將表面的黑色皮膚清創(chuàng)后,露出脂肪但還看不見肌肉、肌腱或是骨骼；病理學(xué)真皮層有大量淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，損傷到肌肉層，臀大肌肌纖維變松，且有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。不可分期：受壓處皮膚變黑變硬,針刺不出血，周圍滲出黃色液體,清除壞死組織和焦痂后,露出表層肌肉；病理學(xué)表皮層和真皮層消失,代之以肉芽組織,伴重度炎癥和出血,臀大肌萎縮甚至消失,深層肌肉局部萎縮,橫紋消失纖維化伴慢性炎癥。4期：鐵片邊緣皮膚紅腫糜爛,有滲液或滲血,伴有骨骼、肌腱或肌肉暴露；病理學(xué)臀大肌消失,深層肌肉多灶狀炎性壞死,伴化膿性炎癥,部分間質(zhì)水腫出血及大片纖維化。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)、方差齊性檢驗(yàn)、Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1復(fù)制模型結(jié)果 1個(gè)循環(huán)后形成1期壓性損傷，5個(gè)循環(huán)后形成2期壓力性損傷，15～20個(gè)循環(huán)后形成深部組織損傷，20個(gè)循環(huán)后形成3期壓力性損傷，20～25個(gè)循環(huán)后形成不可分期，30個(gè)循環(huán)后形成4期壓力性損傷。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中1期組再造摸過(guò)程中1只大鼠可能是由于手術(shù)器械傷及內(nèi)臟而死亡，其他組均無(wú)死亡，成功復(fù)制模型。

2.2MMP-9和TIMP-1在各期壓力性損傷組織中的表達(dá) 見表1，圖1、2。

表1 各組組織中MMP-9和TIMP-1的陽(yáng)性表達(dá)率

與空白組相比：1)P<0.05；與對(duì)照組相比：2)P<0.05；與1期組相比：3)P<0.05；與2期組相比：4)P<0.05；與可疑組相比：5)P<0.05；與3期組相比：6)P<0.05；與不可分期組相比：7)P<0.05

圖1 各組MMP-9的表達(dá)(HE，×400)

圖2 各組TIMP-1的表達(dá)(HE，×400)

MMP-9和TIMP-1在空白組和對(duì)照組中幾乎不表達(dá)，且兩組的表達(dá)情況沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，鐵片對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有干擾；隨著壓力性損傷程度的加深，MMP-9表達(dá)不斷地增加，TIMP-1表達(dá)先上升，在4期組開始降低，MMP-9/TIMP-1的比值不斷顯著增大(均P<0.05)。

3 討 論

壓力性潰瘍具有極大的危害，探究壓力性損傷形成的機(jī)制，找到預(yù)防壓力性損傷的靶點(diǎn)，可以有效降低壓力性損傷的發(fā)生率。

MMP-9的表達(dá)可以促進(jìn)受壓部位組織細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而造成受壓組織的不可逆性損傷。MMP是一組降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶〔7〕，受許多細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，在傷口的愈合和疾病的恢復(fù)過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。其中MMP-9的過(guò)度表達(dá)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而使壓力性損傷的損害不可逆。本研究中，隨著受壓循環(huán)的增多，受壓組織進(jìn)一步惡化，MMP-9表達(dá)顯著增加，細(xì)胞外基質(zhì)降解，使組織易損性增加。研究證明〔8〕，MMP-9在慢性感染創(chuàng)面中的活性較急性創(chuàng)面中高出近125倍，而生長(zhǎng)因子水平卻明顯低下。壓力性損傷的傷口屬于慢性傷口，因此可以推測(cè)出，壓力性損傷的形成過(guò)程也是通過(guò)MMP-9表達(dá)增多從而抑制生長(zhǎng)因子，使傷口變?yōu)椴豢赡鎿p傷。

研究表明TIMP-1和MMP-9關(guān)系密切，TIMP-1主要由炎性細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞產(chǎn)生，廣泛存在于組織和體液中，其主要功能是與MMP-9形成1∶1的復(fù)合物從而抑制MMP-9活性。然而TIMP-1的表達(dá)也受MMP-9表達(dá)程度的控制，MMP-9的過(guò)高表達(dá)也會(huì)抑制TIMP-1的分泌，從而形成惡性循環(huán)促進(jìn)壓力性損傷的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)隨著受壓循環(huán)次數(shù)的增多及壓力性損傷嚴(yán)重程度的加深，TIMP-1的表達(dá)呈先上升后下降趨勢(shì)，MMP-9的表達(dá)增多反過(guò)來(lái)抑制TIMP-1的表達(dá)，從而使壓力性損傷向更深程度發(fā)展。

正常皮膚組織中MMP-9/TIMP-1表達(dá)很少或基本不表達(dá)，對(duì)正常皮膚的維護(hù)作用不大，在創(chuàng)傷和炎癥時(shí)機(jī)體精確調(diào)控炎性細(xì)胞和修復(fù)細(xì)胞合成分泌MMP-9/TIMP-1〔7〕。本實(shí)驗(yàn)可見MMP-9/TIMP-1的表達(dá)失衡是壓力性損傷發(fā)展的一個(gè)重要因素。部分生長(zhǎng)因子在壓力性損傷治療過(guò)程中并不能達(dá)到預(yù)期的效果，這可能與局部增多的MMPs加快了生長(zhǎng)因子和生長(zhǎng)因子的降解有關(guān)，因此在早期壓力性損傷治療過(guò)程中，在生長(zhǎng)因子的干預(yù)下增加MMPs的抑制劑，從而達(dá)到抑制MMPs的活性，預(yù)防早期壓力性損傷向深部壓力性損傷發(fā)展，提高早期壓力性損傷的治愈率。

本研究證明了MMP-9的高表達(dá)可以抑制TIMP-1的表達(dá)，導(dǎo)致MMP-9/TIMP-1的比例失衡是促進(jìn)壓力性損傷發(fā)生發(fā)展的重要因素。MMP-9的表達(dá)不但加速了受壓組織的損壞而且會(huì)降解生長(zhǎng)因子，從而減慢了受壓部位組織的自身修復(fù)。如何調(diào)控MMP-9/TIMP-1在各期壓力性損傷組織中的表達(dá)，使MMP-9/TIMP-1成為預(yù)防壓力性損傷發(fā)生發(fā)展干預(yù)的靶點(diǎn)。