白細(xì)胞介素-22結(jié)合蛋白在腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌發(fā)病中的作用

葉華 涂云

(1廣東醫(yī)科大學(xué)廣東省天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524023；2湛江中心人民醫(yī)院)

結(jié)直腸癌(CRC)的發(fā)生與慢性腸道炎癥有關(guān)，最常見的是炎癥性腸病(IBD)，包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)。炎癥性腸病向CRC發(fā)展的過程中，炎癥因子發(fā)揮重要作用。白細(xì)胞介素(IL)-22能夠促進(jìn)IBD患者腸黏膜愈合，然而，如果不加控制，它可以導(dǎo)致腸道癌癥的發(fā)生〔1,2〕。IL-22結(jié)合蛋白(BP)能夠特異性結(jié)合IL-22，使IL-22不能與IL-22受體(IL-22R)1結(jié)合發(fā)揮作用〔3〕。然而，IL-22BP在腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌(CAC)發(fā)病中的作用還不清楚。因此，筆者建立了小鼠腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌模型，研究IL-22BP的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級雄性C57BL/6小鼠，6～7周齡，體重(20±2)g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2試劑及儀器 氧化偶氮甲烷(AOM)購于美國Sigma公司，葡聚糖硫酸鈉(DSS)(MW:36 000～50 000 D)購自美國MP Bio公司。PCNA和Ki-67單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。兔抗小鼠p-STAT3購自美國CST公司，p-STAT3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自Abnova公司。聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度測定試劑盒和十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)配制試劑盒購自碧云天生物科技研究所。小鼠隱血試劑盒購自南京建成生物工程研究所。組織包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)，組織切片機(jī)RM2235(德國LEICA公司)，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和垂直板電泳槽(美國Bio-Rad公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1小鼠的分組和處理 將30只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組和IL-22BP組。除空白組以外，各組給予生理鹽水配制的AOM溶液(12 mg/kg)腹腔注射1次，觀察1 w后，模型組和IL-22BP組先給予2% DSS溶液自由飲用5 d，再換普通潔凈水飲用16 d，此21 d為1個(gè)循環(huán)，共4個(gè)循環(huán)；空白組則腹腔注射等量的生理鹽水1次，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間一直飲用普通潔凈水。造模于第120天結(jié)束。從每個(gè)循環(huán)的第15天開始，IL-22 BP組腹腔注射0.2 mg/kg IL-22BP，每2天注射1次，重復(fù)4個(gè)循環(huán)。

1.3.2一般情況和成瘤情況觀察 造模期間，每天觀察小鼠進(jìn)食量、精神狀態(tài)、活動(dòng)情況和毛發(fā)亮澤度等，給DSS前1 d及后1 d分別記錄小鼠體重、大便性狀及便血情況，按Cooper法〔4〕進(jìn)行小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評分。第120天處死小鼠，取盲腸至肛門段結(jié)腸，量取長度，并觀察結(jié)腸大體形態(tài)及計(jì)數(shù)腫瘤個(gè)數(shù)。

1.3.3免疫組化法檢測結(jié)直腸腫瘤組織PCNA和Ki-67表達(dá) PCNA和Ki-67按照1∶100稀釋，采用免疫組化SP法觀察PCNA和Ki-67陽性細(xì)胞的定位及變化情況，Image-Pro Plus軟件分析平均光密度。

1.3.4qPCR法檢測結(jié)直腸腫瘤組織STAT3 mRNA表達(dá) 采用Trizol試劑提取結(jié)腸組織的總RNA，根據(jù)兩步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，qPCR擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因，qPCR條件為95℃ 預(yù)變性1 min，95℃變性10 s，60℃退火延伸40 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.3.5ELISA檢測結(jié)直腸腫瘤組織p-STAT3表達(dá) 將待測組織與低溫生理鹽水按照1∶9放入勻漿器充分研磨后，于4℃以5 000 r/min離心5 min，取上清液按ELISA試劑盒要求操作，于450 nm檢測吸光度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1小鼠一般情況 實(shí)驗(yàn)過程中，模型組和IL-22BP組小鼠均出現(xiàn)不同程度消瘦、厭食、脫毛、血便等表現(xiàn)，肉眼比較未發(fā)現(xiàn)兩組有明顯差異。與空白組相比，模型組小鼠在飲用DSS后體重逐漸下降；與模型組相比，IL-22BP組小鼠前期體重變化沒有明顯差異，后期體重下降情況有所緩解。DAI評分方面，IL-22BP組小鼠前期與模型組基本一致，80 d后DAI評分較模型組相比有所升高(圖1)。

2.2小鼠成瘤情況 收集各組小組結(jié)直腸標(biāo)本，縱向剖開，空白組小鼠腸黏膜完整光滑，模型組(10只鼠均成瘤)和IL-22BP組(9只鼠成瘤)小鼠結(jié)直腸可見不同程度充血水腫，有大小不一的腫瘤出現(xiàn)在腸壁的黏膜面，凸向腸腔，少數(shù)呈片狀隆起，多位于近肛門側(cè)。與模型組相比，IL-22BP組小鼠腫瘤數(shù)量明顯降低(16個(gè) vs 36個(gè))，小鼠平均腫瘤數(shù)目由(3.6±1.24)個(gè)減少為(1.6±0.97)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3小鼠結(jié)直腸組織PCNA和Ki-67的表達(dá) 空白組小鼠結(jié)直腸細(xì)胞染色較淺，PCNA和Ki-67中表達(dá)較少；模型組和IL-22BP組PCNA和Ki-67染色明顯增強(qiáng)，范圍較大(圖2)。空白組、模型組和IL-22BP組PCNA平均光密度值分別為0.39±0.06、0.70±0.13和0.61±0.08，IL-22BP組與模型組顯著高于空白組(P<0.05)，IL-22BP組顯著低于模型組(P<0.05)；空白組、模型組和IL-22BP組Ki-67平均光密度值分別為0.48±0.08、0.81±0.16和0.64±0.11，IL-22BP組與模型組顯著高于空白組(P<0.05)，IL-22BP組顯著低于模型組(P<0.01)。

2.4小鼠結(jié)直腸腫瘤組織STAT3 mRNA和p-STAT3表達(dá)的表達(dá) 與空白組相比，模型組小鼠結(jié)直腸腫瘤組織STAT3 mRNA和p-STAT3表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，IL-22BP組STAT3 mRNA和p-STAT3水平均顯著降低(P<0.01)，表明腹腔注射IL-22BP可以下調(diào)STAT3 mRNA和p-STAT3水平。見表1。

表1 小鼠結(jié)直腸腫瘤組織STAT3 mRNA和p-STAT3水平

與空白組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.01

3 討 論

IL-22BP是IL-22的作用受體靶標(biāo)，是一種可溶性Ⅱ類細(xì)胞因子受體，能夠特異性靶向結(jié)合IL-22，結(jié)合過程迅速而且親和力強(qiáng)，是IL-22與IL-22R1結(jié)合強(qiáng)度的50～1 000倍，因此可以阻止IL-22與IL-22R1結(jié)合，抑制IL-22的活性〔5〕。IL-22是IL-10家族的成員之一，具有促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖、分化、遷移，抑制細(xì)胞凋亡，加快上皮細(xì)胞損傷修復(fù)的作用〔6〕。近年多項(xiàng)研究顯示IL-22過表達(dá)與結(jié)直腸癌、肝癌、胃癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系〔7～9〕。Trifari等〔10〕發(fā)現(xiàn)腸道炎癥可上調(diào)IL-22表達(dá)，下調(diào)IL-22BP表達(dá)，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生。PCNA是真核細(xì)胞DNA合成所必需的一種核蛋白，其表達(dá)量在G1期逐漸增加，S期達(dá)最高峰，在G2/M期則逐漸減少〔11〕；Ki-67是一種存在于增殖細(xì)胞中核抗原，其表達(dá)水平愈高表明細(xì)胞增殖愈活躍〔12〕；檢測PCNA和Ki-67的表達(dá)可以反映結(jié)直腸細(xì)胞的增殖活性。本文結(jié)果提示給予IL-22BP可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

STAT3可通過炎癥介質(zhì)，啟動(dòng)細(xì)胞外信號，調(diào)控腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞等的生物學(xué)行為，被認(rèn)為是慢性炎癥促進(jìn)腫瘤和腫瘤相關(guān)性炎癥形成過程中不可缺少的關(guān)鍵分子〔13〕。研究表明，IL-6、IL-22等炎癥因子可以直接與細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶磷酸化級聯(lián)反應(yīng)。在JAK2、MAPK等激酶的作用下，活化成為磷酸化的p-STAT3，進(jìn)而誘導(dǎo)多種與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和血管生成等生物學(xué)行為密切相關(guān)的下游靶基因表達(dá)，如Bcl-2、Cyclin-D1、VEGF等，促進(jìn)結(jié)腸癌、肝癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔14，15〕。本研究結(jié)果顯示，給予IL-22BP可以降低STAT3 mRNA水平，抑制p-STAT3表達(dá)，這可能是IL-22BP抑制腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌的作用機(jī)制之一。但I(xiàn)L-22BP的這一效應(yīng)是直接作用于STAT3還是通過抑制IL-22來實(shí)現(xiàn)的，尚有待進(jìn)一步研究。