MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3在胃低分化腺癌中的表達(dá)及意義

郭海州 安生花 林明哲 李進(jìn)章 周毛 祁艷娟

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院 1寧養(yǎng)院，青海 西寧 810001；2腫瘤內(nèi)科；3腫瘤放療科)

胃腺癌好發(fā)于中老年人，以低分化腺癌較多見(jiàn)〔1〕。淋巴結(jié)和淋巴管播散是其轉(zhuǎn)移的主要方式，在病變形成時(shí)，間質(zhì)可以觀察到小的新形成的淋巴管。間質(zhì)淋巴管是伴隨著腫瘤的生長(zhǎng)而形成的，與淋巴管促進(jìn)因子有密切關(guān)系。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)-D是新發(fā)現(xiàn)的淋巴管生成促進(jìn)因子，通過(guò)VEGF受體(VEGFR)3起重要作用，促進(jìn)D2-40陽(yáng)性的淋巴管生成。腫瘤細(xì)胞侵襲性生長(zhǎng)時(shí)可以浸潤(rùn)脈管，并通過(guò)淋巴道形成播散〔2〕?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家族不僅可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞轉(zhuǎn)移的屏障，還可以促進(jìn)脈管的生成。MMP-12是家族中的一員，最早是在巨噬細(xì)胞中提取的。近年來(lái)認(rèn)為MMP-12可能有多種功能，包括促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)及調(diào)節(jié)脈管生成的作用等〔3〕。本文關(guān)注胃低分化腺癌患者術(shù)后組織中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3蛋白和mRNA的表達(dá)，探討其關(guān)系，分析其臨床意義。

1 材料和方法

1.1臨床資料 選擇2012年1月至2017年5月在青海大學(xué)附屬醫(yī)院確診為胃低分化腺癌，并行手術(shù)根治的患者共73例作為研究組1，均經(jīng)術(shù)后病理確診，并符合世界衛(wèi)生組織(WHO)中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)由醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前放、化療的患者；②有消化系統(tǒng)手術(shù)史的患者；③伴有其他器官腫瘤的患者。其中男38例，女35例，年齡36～85歲，平均61.3歲。選擇20例高-中分化胃腺癌術(shù)后組織作為對(duì)照組1，其中男10例，女10例，年齡37～80歲，平均58.6歲。選擇20例胃黏膜高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織作為對(duì)照組2，其中男10例，女10例，年齡32～78歲，平均54.3歲。選擇20例胃黏膜低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織作為對(duì)照組3，其中男10例，女10例，年齡34～76歲，平均54.1歲。選擇正常胃黏膜組織20例作為對(duì)照組4，其中男10例，女10例，年齡39～79歲，平均62.4歲。選擇胃低分化腺癌的新鮮組織12例作為研究組2，其中男6例，女6例，年齡43～75歲，平均61.5歲。選擇正常胃黏膜組織的新鮮組織12例作為新鮮對(duì)照組，其中男6例，女6例，年齡42～73歲，平均61.6歲。以上各組間在性別、年齡構(gòu)成等因素的比較中無(wú)明顯差異。

1.2免疫組化檢測(cè)MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3的表達(dá) 切片及染色基于石蠟包埋后的組織。MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3的濃縮液均購(gòu)自蘇州睿贏生物公司，應(yīng)用免疫組化SP法進(jìn)行檢測(cè)。先行預(yù)實(shí)驗(yàn)，由病理醫(yī)師觀察，選擇染色效果最理想的濃度用于正式實(shí)驗(yàn)，即MMP-12是1∶300，VEGF-D是1∶200，VEGFR-3是1∶200。正式實(shí)驗(yàn)由同一技師完成，一次性完成，做好質(zhì)控工作，減少人為誤差。

1.3熒光PCR法檢測(cè)MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3 mRNA的表達(dá) 研究組2和新鮮對(duì)照組中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3 mRNA表達(dá)的檢測(cè)應(yīng)用熒光PCR技術(shù)。引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增程序的設(shè)定見(jiàn)表1、2。操作嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)步驟完成，均由同一實(shí)驗(yàn)師完成，并設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，做好質(zhì)控工作。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.4MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3免疫組化結(jié)果的判定 MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3的陽(yáng)性部位均為細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜，結(jié)果判定由病理醫(yī)師完成，選擇上皮細(xì)胞集中的2個(gè)熱點(diǎn)區(qū)進(jìn)行觀察(400倍)。應(yīng)用陽(yáng)性細(xì)胞百分比和著色強(qiáng)度綜合判定。陽(yáng)性細(xì)胞百分比：以0%、≤25%、26%～50%、51%～75%、>75%分別評(píng)定為 0、1、2、3、4 分。著色強(qiáng)度：以無(wú)、淡黃、棕黃、棕褐色分別評(píng)定為 0、1、2、3 分。兩者相加，以最后評(píng)分作為最終判定分?jǐn)?shù)，以≤3分為陰性，以>3分為陽(yáng)性。

1.5MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3熒光PCR結(jié)果的判定 結(jié)果的判讀以通道的循環(huán)閾(Ct)值為未確定的(Undet)或Ct值大于30為陰性，以Ct值小于等于30的樣本為陽(yáng)性，曲線為明顯的S型。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS6.12分析完成，行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、線性相關(guān)分析和Kaplan-Meier生存分析。

2 結(jié) 果

2.1研究組1、對(duì)照組1～4組中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3表達(dá)的比較 五組中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3的表達(dá)差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，即對(duì)照組4、對(duì)照組3、對(duì)照組2、對(duì)照組1、研究組1中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3的表達(dá)陽(yáng)性率有增高趨勢(shì)。見(jiàn)表3、圖1。

表3 各組MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3表達(dá)陽(yáng)性率比較〔n(%)〕

圖1 MMP-12、VEGF-D、VEGFR-3蛋白在胃低分化腺癌中陽(yáng)性表達(dá)(IHC，×200)

2.2研究組2和新鮮對(duì)照組中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3 mRNA的表達(dá) 兩組中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3 mRNA表達(dá)陽(yáng)性率差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表4、圖2。

表4 研究組2和新鮮對(duì)照組MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3 mRNA表達(dá)陽(yáng)性率的比較〔n(%),n=12〕

1：內(nèi)控曲線；2：陽(yáng)性曲線圖2 MMP-12、VEGF-D、VEGFR-3 mRNA在胃低分化腺癌中陽(yáng)性表達(dá)

2.3研究組1中不同臨床特征中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3表達(dá)的比較 研究組1 MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管累犯顯著相關(guān)。MMP-12的表達(dá)與細(xì)胞增殖指數(shù)、腫瘤最大徑和浸潤(rùn)深度密切相關(guān)(P<0.01)。見(jiàn)表5。

2.4研究組1中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3表達(dá)的相關(guān)性分析 研究組1中MMP-12和VEGF-D(r=0.41，P=0.041)、VEGF-D和VEGFR-3(r=0.46，P=0.021)之間均呈顯著正相關(guān)性。

2.5研究組1中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3表達(dá)的生存分析 患者均進(jìn)行隨訪，隨訪截止的時(shí)間為3～60個(gè)月，平均16.9個(gè)月。研究組1中MMP-12(χ2=3.95,P=0.033)、VEGF-D(χ2=4.25,P=0.014)和VEGFR-3(χ2=4.95,P=0.004)的陽(yáng)性率均與患者預(yù)后顯著相關(guān)(P<0.05)，即MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3高表達(dá)患者的預(yù)后差。

表5 研究組1中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3陽(yáng)性率在不同臨床病理特征中的表達(dá)差別〔n(%)〕

3 討 論

胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是主要轉(zhuǎn)移途徑，腫瘤細(xì)胞具有明顯的播散性，遷移性強(qiáng)，患者常伴有脈管癌栓〔4〕。胃低分化腺癌是腫瘤細(xì)胞分化差的表達(dá)，也是胃癌的重要病理形態(tài)學(xué)類型，腫瘤細(xì)胞分布彌漫，細(xì)胞體積小，腺管形成少，易于轉(zhuǎn)移和播散，臨床侵襲行為強(qiáng)。研究認(rèn)為淋巴管和血管受累提示腫瘤轉(zhuǎn)移的可能性明顯增強(qiáng)〔5〕。與淋巴道轉(zhuǎn)移的相關(guān)蛋白近年受到學(xué)者重視，其中淋巴管生成是關(guān)注的熱點(diǎn)之一。VEGF-D是新認(rèn)識(shí)的淋巴管生成因子，其cDNA序列包括419個(gè)堿基對(duì)，其表達(dá)的蛋白包含354個(gè)氨基酸殘基〔6〕。VEGF-D的受體是VEGFR-3。VEGFR-3被認(rèn)為在機(jī)體發(fā)育中是必需的，尤其是在原始心血管系統(tǒng)的形成中有一定的作用。在惡性腫瘤形成時(shí)，VEGFR-3的分泌量明顯增多，主要與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化有關(guān)，且主要表達(dá)部位是淋巴管的內(nèi)皮細(xì)胞〔7〕。VEGF-D/VEGFR-3是腫瘤間質(zhì)淋巴管形成時(shí)的重要通路，可以促進(jìn)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的形成。新形成的淋巴管呈枝芽狀，以“出芽”的形式生長(zhǎng)形成實(shí)性的條索狀結(jié)構(gòu)，在淋巴液的沖擊和間質(zhì)改建過(guò)程中形成有功能的淋巴管。由于新形成的淋巴管與腫瘤組織相鄰，且結(jié)構(gòu)和功能不完善，腫瘤細(xì)胞在生長(zhǎng)時(shí)易于侵入，對(duì)淋巴道播散起重要促進(jìn)作用〔8，9〕。關(guān)于VEGF-D/VEGFR-3通路的影響因素也有學(xué)者關(guān)注。梁任技等〔10〕通過(guò)觀察非小細(xì)胞肺癌(鱗癌和腺癌)中MMP-12的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MMP-12能促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，同時(shí)可以促進(jìn)VEGF-D的表達(dá)，認(rèn)為二者可能對(duì)病變的形成有明顯的作用，二者的關(guān)聯(lián)性可能是治療的靶點(diǎn)。MMP家族中有多個(gè)成員，結(jié)構(gòu)上有一定的同源性，其特征性結(jié)構(gòu)是含有鋅和鈣離子。MMPs均能對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜、Ⅳ型膠原、層黏連蛋白等間質(zhì)成分進(jìn)行溶解破壞，使腫瘤轉(zhuǎn)移的屏障破壞，腫瘤細(xì)胞易于遷移〔11〕。MMP-12是家族中的重要成員，是作為彈性水解酶被認(rèn)識(shí)的，研究認(rèn)為MMP-12可以降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的所有成分，其基因定位于11q22.3，cDNA全長(zhǎng)1 800 bp，活化的MMP-12是以54 kD的酶原分泌，在水解作用后產(chǎn)生有活性的酶，可以激活MMP-2和MMP-3，引起MMP-12水解的級(jí)聯(lián)反應(yīng)〔12，13〕。近年研究認(rèn)為MMP-12可能和脈管生成有一定關(guān)聯(lián)〔14〕。

本研究結(jié)果顯示研究組1中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3的表達(dá)顯著高于其他四組，正常胃黏膜、低級(jí)別、高級(jí)別、高-中分化腺癌、低分化腺癌中三者的表達(dá)有升高趨勢(shì)，提示三者是促進(jìn)病變形成的重要蛋白因素。結(jié)果顯示低分化腺癌新鮮組織中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3 mRNA高于正常組織，提示蛋白和mRNA的表達(dá)有高度的一致性。結(jié)果顯示研究組1中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管累犯有關(guān)，提示三者對(duì)促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移有明顯作用。相關(guān)性分析顯示研究組1中MMP-12和VEGF-D、VEGF-D和VEGFR-3均具有正相關(guān)性，提示MMP-12可能是VEGF-D/VEGFR-3通路的重要影響蛋白，也提示MMP-12與淋巴管新生的作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF-D起作用的。胃腺癌中可見(jiàn)淋巴管新生，這為腫瘤轉(zhuǎn)移提供了便捷的通路，腫瘤細(xì)胞易于播散，同時(shí)由于同質(zhì)性黏附力的下降，腫瘤細(xì)胞易于離開(kāi)原發(fā)病灶，進(jìn)入脈管，并定植于異源性組織處形成轉(zhuǎn)移灶。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MMP-12的表達(dá)與細(xì)胞增殖指數(shù)、腫瘤最大徑、浸潤(rùn)深度密切相關(guān)，提示MMP-12可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲，也提示低分化腺癌中MMP-12的作用方式可能更多元化。MMP-12在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)高，對(duì)腫瘤的侵襲和作用強(qiáng)，與癌基因的作用類似，同時(shí)對(duì)間質(zhì)的作用更明顯〔15〕。MMP-12還可能對(duì)腫瘤細(xì)胞周圍炎性環(huán)境的調(diào)控有一定作用，引起癌性間質(zhì)的活躍增殖，對(duì)促進(jìn)轉(zhuǎn)移可能與有一定意義〔16〕。本實(shí)驗(yàn)的生存分析證實(shí)MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3的表達(dá)與生存時(shí)間(預(yù)后)有關(guān)，即三者高表達(dá)患者的預(yù)后較差，這可能臨床判斷預(yù)后一定的價(jià)值。

綜上，胃低分化腺癌中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3高表達(dá)且具有協(xié)同作用，對(duì)腫瘤的形成和進(jìn)展有促進(jìn)作用，MMP-12可能對(duì)淋巴管生成通路VEGF-D/VEGFR-3有一定的促進(jìn)作用。