9型腺相關(guān)病毒攜帶IL4對(duì)阿爾茲海默病模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

張淑萍，許鵬嬌，辛 華，姜曉雪，劉文娟

阿爾茲海默病(Alzheimer’ s disease，AD)是一組中老年起病的常見(jiàn)的慢性進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，伴有認(rèn)知記憶能力損傷、智力減退和行為人格退化。研究發(fā)現(xiàn)AD 患者神經(jīng)元細(xì)胞外淀粉樣蛋白(amyloid β- protein，Aβ)沉積，晚期可激活巨噬細(xì)胞引發(fā)炎性反應(yīng)。巨噬細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分為兩型，M1型巨噬細(xì)胞激活后可加重炎癥反應(yīng)，使 Aβ沉積進(jìn)一步加重而促進(jìn)AD進(jìn)展，形成惡性循環(huán)。M2型巨噬細(xì)胞可通過(guò)分泌抗炎因子抑制炎癥進(jìn)展[1]。基于目前國(guó)內(nèi)外研究已知IL-4是激活巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞極化的主要因子[2]。

基因治療已經(jīng)成為許多疾病治療的研究方向，其優(yōu)點(diǎn)在于只需一次注射便可持續(xù)表達(dá)目的基因，且安全、轉(zhuǎn)染效率高。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，重組腺相關(guān)病毒rAAV已經(jīng)成為外源基因干預(yù)治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)工具載體。在眾多用于基因治療的病毒載體中，目前唯一沒(méi)有引起人類(lèi)宿主任何病理反應(yīng)的是rAAV載體[3，4]，且其宿主范圍廣、表達(dá)穩(wěn)定，被認(rèn)為是目前較理想的轉(zhuǎn)運(yùn)載體。有研究證實(shí)在神經(jīng)系統(tǒng)中AAV9 表達(dá)較腺相關(guān)病毒其他分型高，且靜脈給藥時(shí)AAV9 血腦屏障通過(guò)率較高?；谏鲜鲇^點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)利用過(guò)表達(dá)IL4的9型腺相關(guān)病毒，促使巨噬細(xì)胞向M2型極化，研究其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響。

為了評(píng)估AAV9-IL4對(duì)于 AD的防治作用，行為學(xué)測(cè)試不可或缺。本實(shí)驗(yàn)利用Aβ1-42蛋白沉積制作的老年癡呆模型，在此模型的基礎(chǔ)上將過(guò)表達(dá)IL4的9型腺相關(guān)病毒尾靜脈注射到大鼠體內(nèi)，用水迷宮檢測(cè)模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，從而為針對(duì)AD患者臨床治療提供新的線索，為針對(duì)AD的免疫治療提供新的理論依據(jù)[5]。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境 SPF 級(jí) SD 大鼠75只，雄性，3月齡，體重(300 ±20)g，利用海馬區(qū)注射Aβ1-42制作老年癡呆模型，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的所有動(dòng)物及其飼養(yǎng)按照中國(guó)動(dòng)物保護(hù)法相關(guān)條例進(jìn)行，倫理學(xué)方面符合黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)要求。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和處理 利用海馬區(qū)注射Aβ1-42制作老年癡呆模型的雄性SD大鼠75只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組39只大鼠，尾靜脈注射AAV9-IL4，對(duì)照組36只，尾靜脈注射等同劑量的AAV9空載。

1.3 大鼠進(jìn)行尾靜脈注射AAV9-IL4 對(duì)已構(gòu)建好的AD模型大鼠AD手術(shù)后1 d就開(kāi)始進(jìn)行尾靜脈注射包裝并測(cè)定好滴度的腺相關(guān)病毒(滴度5*10^13 v。g/ml)AAV9-IL4與AAV9空載對(duì)照。實(shí)驗(yàn)組的大鼠經(jīng)尾靜脈注射5 μl AAV9-IL4，對(duì)照組大鼠注射同等劑量的AAV9空載，持續(xù)14 d。

1.4 水迷宮檢測(cè)模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力 我們分別采用經(jīng)典的Morris水迷宮進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)手術(shù)2 w，4 w，8 w后大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。水迷宮直徑設(shè)置為150 cm，高60 cm，第一象限內(nèi)放置一平臺(tái)，平臺(tái)直徑12 cm。池水深30 cm(高出平臺(tái)2 cm)，設(shè)置成不透明黑色。大鼠是否能夠在水迷宮測(cè)試中順利找到平臺(tái)，除了受空間、學(xué)習(xí)記憶能力影響外，還受到大鼠本身視覺(jué)以及游泳速度等條件的影響[6]。本實(shí)驗(yàn)的根本目的是檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)大鼠的學(xué)習(xí)以及記憶能力，所以，參照學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)設(shè)置在水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)前，以除外游泳速度以及視覺(jué)等因素對(duì)大鼠的干擾。

(1)參照學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)：將大鼠面向池壁在第一象限中央位置放入水中，讓其尋找平臺(tái)。如果60 s內(nèi)成功找到，大鼠平臺(tái)上休息10 s；若 60 s內(nèi)未能找到，則引導(dǎo)至平臺(tái)上，同樣休息 10 s。此目的是確保所有實(shí)驗(yàn)大鼠有相等的時(shí)間來(lái)觀察和獲取空間信息，除外視覺(jué)因素對(duì)大鼠的干擾。

(2)定位航行實(shí)驗(yàn)：每次隨機(jī)從4個(gè)區(qū)域中的其中一個(gè)將大鼠面向池壁放入池中，記錄大鼠逃避潛伏期(逃避潛伏期：大鼠在池內(nèi)游泳至找到水面下的平臺(tái)的時(shí)間)。找到平臺(tái)后，允許大鼠在上停留30 s。若超過(guò)60 s后仍然沒(méi)有找到平臺(tái)，引導(dǎo)大鼠，潛伏期則記為60 s。定位巡航試驗(yàn)持續(xù)5 d，2次/d。

(3)空間探索實(shí)驗(yàn)：在定位航行實(shí)驗(yàn)后1 d，將水下平臺(tái)移除。為檢測(cè)大鼠記憶能力，隨機(jī)選擇一個(gè)位置將大鼠面向池壁放入池中，記錄大鼠在第1象限內(nèi)游泳時(shí)間占總游泳時(shí)間的百分比以及60 s內(nèi)的穿越原平臺(tái)象限的次數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠2 w時(shí)間點(diǎn)逃逸潛伏期 通過(guò)與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠逃逸潛伏期明顯縮短(F=140.21，P<0.001)。比較1～5 d實(shí)驗(yàn)組大鼠逃逸潛伏期，大鼠逃逸潛伏期明顯縮短(F=148.49，P<0.001)，可證明實(shí)驗(yàn)組大鼠有學(xué)習(xí)記憶能力(見(jiàn)表1)。

2.2 兩組大鼠4 w時(shí)間點(diǎn)逃逸潛伏期 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，大鼠逃逸潛伏期明顯縮短(F=1018.57，P<0.001)。1～5 d實(shí)驗(yàn)組大鼠逃逸潛伏期明顯縮短(F=41.69P<0.001)(見(jiàn)表2)。

2.3 兩組大鼠8 w時(shí)間點(diǎn)逃逸潛伏期 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，大鼠逃逸潛伏期明顯縮短(F=634.40，P<0.001)。1～5 d實(shí)驗(yàn)組大鼠逃逸潛伏期明顯縮短(F=34.72，P<0.001)(見(jiàn)表3)。

2.4 兩組大鼠穿越隱藏平臺(tái)的次數(shù)及在目標(biāo)限游泳時(shí)間占總游泳時(shí)間的百分比 通過(guò)與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增多(F=109.23，P<0.001)，且實(shí)驗(yàn)組2 w與4 w大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)有差別，4 w與8 w相比較差別不明顯。在目標(biāo)限游泳時(shí)間占總游泳時(shí)間的百分比明顯延長(zhǎng)(F=675.56P<0.001)，且實(shí)驗(yàn)組2 w與4 w在目標(biāo)限游泳時(shí)間占總游泳時(shí)間的百分比差別不明顯，4 w與8 w相比有差別(見(jiàn)表4)。

表1 2 w時(shí)間點(diǎn)逃逸潛伏期比較

Comparison between control group and experimental group*P<0.001

表2 4 w時(shí)間點(diǎn)逃逸潛伏期比較

Comparison between control group and experimental group*P<0.01

表3 8 w時(shí)間點(diǎn)逃逸潛伏期比較

Comparison between control group and experimental group*P<0.001

表4 目標(biāo)限游泳時(shí)間占總游泳時(shí)間的百分比

Comparison between control group and experimental group*P<0.001

通過(guò) Two-Way ANOVA統(tǒng)計(jì)分析比較各組間逃逸潛伏期，我們發(fā)現(xiàn) IL4-AAV9組SD大鼠逃逸潛伏期明顯低于 AAV9組SD大鼠。定位航行實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)：隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，各組大鼠池內(nèi)游泳至找到水面下的平臺(tái)的時(shí)間明顯縮短，證明大鼠有學(xué)習(xí)記憶能力。我們比較了各組大鼠在 60 s內(nèi)穿越原平臺(tái)象限的次數(shù)及其在第一象限內(nèi)游泳時(shí)間占總游泳時(shí)間的百分比?？臻g探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：IL4-AAV9 組單位時(shí)間平均穿越平臺(tái)次數(shù)顯著高于AAV9組，且2 w、4 w差異顯著，4 w、8 w無(wú)明顯差異。IL4-AAV9 組單位時(shí)間目標(biāo)象限游泳時(shí)間占總時(shí)間比顯著高于AAV9組，且2 w、4 w無(wú)明顯差異，4 w、8 w差異顯著。

3 討 論

AD是一種以記憶損害為主，認(rèn)知功能改變?yōu)樘卣鞯闹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)退行性疾病。目前普遍認(rèn)為AD發(fā)病機(jī)制中的中心環(huán)節(jié)為Aβ1-42蛋白的沉積，Aβ1-42蛋白的生成與清除失衡是細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)最終導(dǎo)致老年癡呆發(fā)生的主要原因[7，8]。記憶損害是 AD 患者最早期、最典型的臨床表現(xiàn)，也是判定AD患者嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)。為了檢測(cè)記憶能力，行為學(xué)檢測(cè)是 AD 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中必不可少的，行為學(xué)檢測(cè)方法多種多樣，檢測(cè)的目標(biāo)也各有不同[9]。Morris 水迷宮作為行為學(xué)檢測(cè)的一種方法，可以從學(xué)習(xí)記憶和空間探索兩方面來(lái)檢測(cè)大鼠的認(rèn)知水平。動(dòng)物的學(xué)習(xí)和記憶能力也會(huì)受到環(huán)境、心理和自身等多方面的影響[10]，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持室內(nèi)燈光、濕度和溫度不變，排除實(shí)驗(yàn)環(huán)境的干擾；實(shí)驗(yàn)過(guò)程中飼養(yǎng)員和實(shí)驗(yàn)員固定，排除大鼠心理因素的干擾。

腺相關(guān)病毒血清學(xué)種類(lèi)較多，其中AAV9 在 CNS 疾病中的療效已得到肯定[11～13]。AAV9在不同的注射方式下可展現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)導(dǎo)特性，其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率因病毒包裝加工、疾病模型和實(shí)驗(yàn)方法的不同存在差異。研究表明，肌注腺相關(guān)病毒會(huì)引發(fā)與注射劑量相關(guān)的 T 細(xì)胞免疫反應(yīng)[14]，尾靜脈給藥相比之下較為傳統(tǒng)、簡(jiǎn)單、微創(chuàng)且具有單次注射即可實(shí)現(xiàn) CNS 普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)的特點(diǎn)。另外，不同滴度不同注射劑量注射對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶改善的影響也不盡相同。已知IL-4是激活巨噬細(xì)胞向M2型極化的主要因子，本研究利用了海馬區(qū)注射Aβ1-42制作的老年癡呆模型，在此模型的基礎(chǔ)上將過(guò)表達(dá)IL4的9型腺相關(guān)病毒尾靜脈注射到大鼠體內(nèi)，用水迷宮檢測(cè)模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，結(jié)果顯示，尾靜脈轉(zhuǎn)染AAV9-IL4后，AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和探索能力均得到了明顯改善。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IL4-AAV9能夠顯著改善SD大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。

因此，應(yīng)進(jìn)一步研究AAV9轉(zhuǎn)導(dǎo)IL4使巨噬細(xì)胞極化在AD模型中如何發(fā)揮作用的可能機(jī)制。