雙歧桿菌微膠囊的制備及其穩(wěn)定性研究

張孟雪，蔡為榮

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

作為人體和動物體內(nèi)的優(yōu)勢菌群，雙歧桿菌具有很多優(yōu)良特性，可以預(yù)防腸道感染，維持膽固醇水平，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，改善乳糖不耐受的情況等[1-2]。但是要獲得理想的治療效果，必須使益生菌保持高活性并能夠定殖到人體的腸道中，只有這樣益生菌才能發(fā)揮作用[3-5]。由于雙歧桿菌的活性受pH影響較大，在攝入過程中受胃腸道內(nèi)環(huán)境影響，難以成功到達(dá)腸道內(nèi)并存活，因此雙歧桿菌微膠囊顯示了優(yōu)良的特性。微膠囊包裹的雙歧桿菌延長了雙歧桿菌的存活率，使得雙歧桿菌被攝入后到達(dá)腸道發(fā)揮作用的活菌數(shù)大大提高[6]。目前，研究最多的是微膠囊的包埋技術(shù)，在食品行業(yè)中，研究和應(yīng)用比較成熟的微膠囊化技術(shù)有擠壓法、乳化法和噴霧干燥法[7-8]，將益生菌包埋進(jìn)腸溶性壁材中制備成微膠囊，這不僅僅能夠增強(qiáng)菌體對有害環(huán)境的抗性，還能夠讓微膠囊中的益生菌在宿主腸道適宜的條件下被快速地釋放出來。微膠囊包埋法大大提高了益生菌在宿主腸道中的存活率，從而更好地發(fā)揮益生菌的作用[9-11]。微膠囊既可以維持微生物的活性又能夠使其穩(wěn)定保存，還可以提高微生物類產(chǎn)品生產(chǎn)效率以及便于控制工藝過程，幫助細(xì)菌防御外部環(huán)境的侵?jǐn)_，保持其活性[12-14]。微膠囊壁材要形成薄膜將芯材包裹住，除了以上的特點(diǎn)之外，最重要的一點(diǎn)是制備出的微膠囊要具有良好的腸溶性并且耐胃酸腐蝕，這樣微膠囊才能夠經(jīng)過消化道到達(dá)腸道內(nèi)并釋放雙歧桿菌發(fā)揮作用[15]。實(shí)驗(yàn)選擇海藻酸鈉等作為壁材，將雙歧桿菌菌體與果膠低聚糖混合作為芯材進(jìn)行包裹，提高雙歧桿菌到達(dá)人體內(nèi)的活菌量，用擠壓注射法制備微膠囊并分析微膠囊在模擬消化液中的穩(wěn)定性情況。

1 材料與設(shè)備

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

鹽酸、NaCl、NaH2PO4、CaCl2、海藻酸鈉、胃蛋白酶、胰蛋白酶、殼聚糖、磷酸二氫鉀等試劑均為國產(chǎn)分析純試劑；果膠低聚糖，實(shí)驗(yàn)室自制；兩歧雙歧桿菌，實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平；pH計；5 mL針式注射器恒溫震蕩培養(yǎng)箱；可見分光光度計；掃描電鏡(SEM)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

(1)微膠囊制備。將厭氧培養(yǎng)得到的雙歧桿菌菌液6 000 r/min離心10 min分離后，用0.9%無菌生理鹽水洗滌菌體沉淀數(shù)次，與實(shí)驗(yàn)所得果膠低聚糖混合(添加量5%(W/V))，再與1.5%(W/V)的海藻酸鈉溶液均勻混合，用5 mL無菌注射器將雙歧桿菌與海藻酸鈉混合溶液注入到1.6%的CaCl2溶液中， 形成海藻酸鈣凝膠珠。然后在0.3%(V/V)的殼聚糖溶液(殼聚糖用0.01%的醋酸溶解)中進(jìn)行成膜反應(yīng)形成膠囊外膜，30 min后用蒸餾水洗除未反應(yīng)的殼聚糖，收集微膠囊(P-MCL)于培養(yǎng)皿中，將其真空冷凍干燥密封保存。再按此方法制備不含果膠低聚糖的微膠囊(MCL)。

(2)模擬消化液的配制。模擬胃液的配制[15]：量取無菌蒸餾水約800 mL，向其中加入16.40 mL的稀鹽酸(0.1 mol/L)和10 g胃蛋白酶，攪拌均勻，定容至1 000 mL， pH約為1.2，溶液用0.22 μm膜過濾除菌備用。模擬腸液的配制：量取無菌蒸餾水約500 mL，加入6.8 g的磷酸二氫鉀，攪拌至溶解，再量取一定量無菌蒸餾水，加入10 g胰蛋白酶，攪拌至溶解，將兩溶液混合后定容至1 000 mL， pH約為7.4，溶液用0.22 μm膜過濾除菌備用。模擬膽汁液配制[16]：將7號膽鹽(膽酸-脫氧膽酸鈉鹽混合物，膽酸含量≥65%)溶解到無菌蒸餾水中，配制質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為1%的膽汁鹽溶液。解囊液[15]：3%檸檬酸鈉水溶液。

(3)微膠囊在模擬人工胃液中的溶解特性。根據(jù)李來酉[16]等方法改良，稱取0.2 g凍干的微膠囊樣品，將其溶于40 mL人工模擬胃液中，在37 ℃、155 r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中震蕩溶解，每隔15 min取樣測定溶液在波長600 nm處的吸光度值，再根據(jù)溶液吸光度值的變化分析微膠囊在人工胃液中的溶解情況。

(4)微膠囊在模擬人工腸液中的溶解特性。同1.3(3)實(shí)驗(yàn)方法，稱取0.2 g凍干的微膠囊樣品，將其溶于40 mL人工模擬腸液中， 在37 ℃、155 r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中震蕩溶解。每隔15 min取樣品溶液測其在波長600 nm處的吸光度值，再根據(jù)溶液的吸光度值變化分析微膠囊在人工腸液中的溶出情況。

(5)微膠囊活菌計數(shù)。將微膠囊置于模擬胃液中處理1 h、模擬膽汁液中處理12 h后，再將其置于模擬腸液中按1.3(4)最快崩解時間處理后，將溶液在 6 000 r/min條件下離心10 min，用PBS緩沖液清洗一次，進(jìn)行活菌計數(shù)。

(6)微膠囊的包埋率、腸溶釋放率的測定[15]。將發(fā)酵培養(yǎng)后的雙歧桿菌菌懸液在6 000 r/min條件下離心10 min后，用無菌蒸餾水洗滌數(shù)次進(jìn)行活菌計數(shù)；稱取0.2 g 的微膠囊，用無菌蒸餾水清洗，待洗去微膠囊表面的活菌，將其置于解囊液中，計算活菌數(shù)記為P；再分別稱取0.2 g 的微膠囊，將其分別加入到解囊液和人工模擬腸液中，一段時間后分別計算解囊液和腸液中的總活菌數(shù)，分別記為Q和R。

微膠囊表面活菌數(shù)(K)=解囊液中總活菌數(shù)(Q)-微膠囊內(nèi)部活菌數(shù)(P),

(1)

稱取干燥后的微膠囊樣品0.2 g，分散于40 mL的腸液中，37 ℃恒溫水浴振蕩，處理30 min后進(jìn)行活菌計數(shù)，包埋率：

(2)

式中,C1為所測稀釋液中的活菌數(shù)(CFU/g)；C0為起始添加的活菌數(shù)(CFU/g)。

(3)

(7)雙歧桿菌微膠囊的穩(wěn)定性研究。根據(jù)經(jīng)典加速實(shí)驗(yàn)，將微膠囊放置在37 ℃條件下保持恒溫，相對濕度保持在60%～65%，存儲3個月后測定微膠囊中的活菌數(shù)，此時的活菌數(shù)衰減速度就相當(dāng)于在室溫的條件下存儲1年以上后的活菌數(shù)衰減速度[17]。將上述實(shí)驗(yàn)操作重復(fù)3次增加實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。

(8)雙歧桿菌微膠囊結(jié)構(gòu)觀察。①微膠囊外部觀察。對干燥的微膠囊樣品進(jìn)行噴金處理，在電壓為15 kV條件下，掃描電鏡觀察微膠囊的表觀形態(tài)。②微膠囊內(nèi)部觀察。微膠囊濕樣品在載玻片上切片后用無菌蒸餾水清洗，真空冷凍干燥。干燥樣品噴金處理后，掃描電微鏡觀察微膠囊的內(nèi)部形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微膠囊在模擬消化液中的穩(wěn)定性分析

通過微膠囊在模擬胃液、模擬腸液中吸光度值的變化以及對比膽汁鹽處理后菌體存活率和微膠囊在模擬腸液、解囊液中的溶解情況來分析其穩(wěn)定性。

微膠囊在模擬胃液中的溶解情況如圖1所示。圖1中P-MCL和MCL分別表示添加果膠低聚糖的微膠囊和未添加果膠低聚糖的微膠囊，結(jié)果顯示兩種微膠囊在模擬胃液中的吸光度值基本無變化，在胃液中基本不溶解，表明微膠囊的抗酸能力較強(qiáng)。

微膠囊在模擬腸液中的溶解情況如圖2所示。由圖2可知，兩種微膠囊均可以在模擬腸液中溶解，吸光度值隨時間增大而增大。MCL在15 min左右基本崩解完全，菌體全部溶出，吸光度值穩(wěn)定在1.6左右，而P-MCL在15 min后加快崩解， 30 min左右崩解完全，菌體全部溶出，溶液的吸光度值穩(wěn)定在1.7左右。其中，菌懸液在模擬胃液和模擬腸液中隨時間變化其吸光度值基本維持不變，微膠囊腸溶性良好。

圖1 微膠囊在模擬胃液中的溶解情況 圖2 微膠囊在模擬腸液中的溶解情況

P-MCL、MCL和菌懸液在膽汁鹽中的穩(wěn)定性如圖3所示。由圖3可知，P-MCL和MCL經(jīng)膽汁鹽處理12 h后雙歧桿菌存活率可高達(dá)75.3%和69.2%，而菌懸液中雙歧桿菌的存活率為49.6%，表明經(jīng)過包埋后的雙歧桿菌具有較好的耐膽汁鹽的能力，且添加低聚糖有助于雙歧桿菌存活率的提高。

P-MCL在模擬腸液和解囊液中的溶解情況如圖4所示。由圖4可以看出，P-MCL在模擬腸液和解囊液中的兩條溶解曲線基本重合，表明微膠囊具有良好的腸溶性，符合微膠囊的制備要求。

圖3 P-MCL、MCL和菌懸液在膽汁鹽中的穩(wěn)定性 圖4 P-MCL在模擬腸液和解囊液中的吸光度變化

2.2 微膠囊活菌計數(shù)結(jié)果分析

將模擬消化液處理后的微膠囊溶解液接種到培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)48 h后進(jìn)行平板計數(shù)。微膠囊活菌計數(shù)如圖5所示。圖5a的稀釋倍數(shù)為108，圖5b、圖5c、圖5d的稀釋倍數(shù)為109，可以看出表面生長的雙歧桿菌菌落光滑且分布均勻，其中圖5a是菌懸液經(jīng)模擬消化液處理后的活菌數(shù)，圖5b是P-MCL未經(jīng)模擬消化液處理的微膠囊活菌數(shù)，圖5c和圖5d是經(jīng)過模擬消化液處理后的微膠囊活菌數(shù)，計算得出培養(yǎng)皿中的活菌數(shù)分別為1.3×107CFU/mL、7.5×109CFU/mL、3×109CFU/mL和4.75×109CFU/mL。結(jié)果表明，未包埋的雙歧桿菌經(jīng)過模擬消化液處理后活菌數(shù)大大降低，模擬消化液處理前后P-MCL中活菌數(shù)未發(fā)生數(shù)量級的變化，說明微膠囊對雙歧桿菌具有良好的保護(hù)作用，包埋后的雙歧桿菌在消化道中的存活率有很大提高。

圖5 微膠囊活菌計數(shù)

2.3 微膠囊包埋率和腸溶率計算

實(shí)驗(yàn)所得到的微膠囊，其膠囊內(nèi)部的活菌數(shù)、解囊液中的總活菌數(shù)以及模擬腸液中的總活菌數(shù)分別為 4.34×108CFU/mL、1.03×109CFU/mL、4.75×109CFU/mL。 根據(jù)式(2)計算出包埋率為 76.85%，由式(3)計算出腸溶釋放率為87.92%，表明實(shí)驗(yàn)制備的微膠囊對雙歧桿菌的包埋效果好，具有腸溶速度快，能夠釋放出大量的雙歧桿菌活菌的特點(diǎn)。

2.4 微膠囊穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

將微膠囊(P-MCL)放置在加速實(shí)驗(yàn)條件下，經(jīng)活菌計數(shù)測定3個月后微膠囊內(nèi)活菌數(shù)基本都可以達(dá)到108數(shù)量級，而以未包埋的雙歧桿菌作為對照的實(shí)驗(yàn)中，未包埋的菌懸液中活菌數(shù)數(shù)量級均降到104以下，說明微膠囊對雙歧桿菌具有良好的保護(hù)作用。微膠囊穩(wěn)定性分析如表1所示。

表1 微膠囊穩(wěn)定性分析

2.5 微膠囊掃描電鏡圖片分析

圖6 P-MCL表觀圖

以海藻酸鈉進(jìn)行一次包埋，經(jīng)注射器注射到氯化鈣溶液中形成凝珠狀，再用殼聚糖進(jìn)行二次包埋，真空冷凍干燥得到微膠囊樣品，并通過SEM進(jìn)行觀察。

制備得到的微膠囊P-MCL外觀如圖6所示，呈乳白色球體狀，粒徑分布比較均勻，成型較好。P-MCL和未包埋雙歧桿菌的掃描電鏡圖如圖7所示。由圖7可知，微膠囊表面形狀略不規(guī)則，多孔疏松。微膠囊表面可以看見部分裸露的菌體，其切片橫截面圖片中可以看出包埋在微膠囊內(nèi)部的大量菌體，表明實(shí)驗(yàn)方法可以將雙歧桿菌有效地包裹在膠囊內(nèi)。

圖7 P-MCL和未包埋雙歧桿菌的掃描電鏡圖

3 結(jié)論

擠壓注射法制備得到微膠囊(P-MCL)，其外觀呈乳白色球體狀，粒徑分布略不均勻，但總體粒徑較小，成型較好。通過掃描電鏡觀察后發(fā)現(xiàn)，微膠囊表面形狀略不規(guī)則，粒徑較小，部分有凹陷，可能是外力擠壓造成的。微膠囊的包埋率為 76.85%，腸溶釋放率為87.92%，包埋效果好，具有腸溶速度快，能夠釋放出大量的雙歧桿菌活菌的特點(diǎn)。微膠囊在胃液中基本不溶解，在膽汁鹽作用12 h后菌體存活率依然高達(dá)70%以上，表明其耐酸能力和耐膽鹽性能良好，而且微膠囊可以在模擬腸液中快速崩解，因此其在人體內(nèi)可以順利到達(dá)腸道內(nèi)并釋放活菌；經(jīng)模擬人體內(nèi)環(huán)境液處理后的微膠囊其活菌數(shù)為4.75×109CFU/mL，表明微膠囊中的活菌數(shù)含量較高，微膠囊包裹雙歧桿菌后可以大大提高其在胃腸道中的存活率。