煙草黑脛病拮抗菌的篩選、鑒定和防病潛力

陸新莉, 雷 庭, 邱克剛, 江 彤, 丁 婷, 黃衍章, 齊永霞

(1. 貴州省黔南州煙草公司， 都勻 558000； 2. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院， 合肥230036)

由Phytophthoraparasiticavar.nicotianae引起的煙草黑脛病是植煙區(qū)煙草上的重要病害。該病害可以危害晾煙、烤煙、香料煙等所有栽培煙草，已成為制約煙草產(chǎn)業(yè)優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)產(chǎn)的重要限制因素[1-4]。黑脛病在我國各煙草種植區(qū)均有不同程度的發(fā)生，皖、豫、云、黔、閩等地發(fā)生相對普遍[5-6]。一般田塊發(fā)病率為5%～12%，重病田塊發(fā)病率高達75%以上，甚至毀產(chǎn)[1,7-8]。目前，該病的防治仍以使用甲霜靈等苯基酰胺類內(nèi)吸殺菌劑為主，但長期、大量、單一地使用同一類型殺菌劑，易造成病菌抗藥性的產(chǎn)生。采用抗病品種是防治煙草黑脛病最經(jīng)濟、有效的措施，但抗病品種的培育又存在抗源少、育種時間長、抗病性與品種之間存在矛盾等問題[9-10]。生物防治因具有與環(huán)境兼容性好、無殘留、不傷害非靶標(biāo)生物等優(yōu)點，在煙草病害的防治中備受關(guān)注。近年來，利用細(xì)菌特別是植物根際促生細(xì)菌防治植物土傳病害的報道也越來越多[11]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對煙草黑脛病具有防治作用的根際細(xì)菌主要是芽孢桿菌(Bacillussp.)[12-15]。

煙草黑脛病是黔南煙區(qū)的重要土傳病害，嚴(yán)重制約黔南煙葉生產(chǎn)。為明確煙草根際土壤拮抗菌對黔南煙草黑脛病的控制效果，作者從黔南煙草種植區(qū)采集樣本，通過室內(nèi)分離、純化、鑒定，初步篩選出對煙草黑脛病菌具有較好抑制作用的生防菌株；并通過盆栽試驗初步探討了生防菌株對煙草黑脛病的防治效果，以期為豐富煙草黑脛病的生防資源和開發(fā)利用優(yōu)良生防菌株提供指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

煙草黑脛病菌：分離自貴州省黔南州發(fā)病煙株，并鑒定為煙草黑脛病菌。

1.1.2 供試藥劑

100億/g枯草芽孢桿菌WP(德強生物股份有限公司)；58%甲霜·錳鋅WP(四川國光農(nóng)化股份有限公司)。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基[16]；燕麥培養(yǎng)基(OA培養(yǎng)基)[16]。

1.1.4 供試煙草根際土壤

2016年7月在貴州省黔南州貴定、福泉、甕安、龍里等4個植煙區(qū)采集健康煙草根際土壤，帶回實驗室備用。

1.2 方法

1.2.1 根際細(xì)菌的分離

采用稀釋涂布平板法[17]。將煙草根際土樣過篩后，稱取土樣10 g，加無菌水定容到100 mL后放入無菌玻璃珠， 200 r/min充分振蕩30 min。取上述土壤懸浮液按10n進行梯度稀釋至10-6。吸取10-4、10-5和10-63個稀釋度的菌懸液0.2 mL，用涂布棒均勻涂布在NA平板上，28 ℃培養(yǎng)2 d，3次重復(fù)。選擇培養(yǎng)性狀不同的單菌落進行純化培養(yǎng)。

1.2.2 對峙培養(yǎng)試驗

采用平板對峙培養(yǎng)法[18-19]。將煙草黑脛病菌在OA平板上活化3 d后，用半徑3 mm的打孔器沿菌落邊緣制備菌碟。采用十字交叉法，用接種環(huán)蘸取1環(huán)細(xì)菌菌株點接在距平板中心位置2.5 cm處，每個平皿接4點。重復(fù)4次。以不接細(xì)菌，只接病原菌的平皿作對照， 25 ℃培養(yǎng)3 d，測量菌落半徑。菌絲生長抑制率按下式[20]計算：

菌絲生長抑制率(%)=(對照菌落半徑-處理菌落半徑)/對照菌落半徑 ×100%

1.2.3 根際細(xì)菌代謝液對煙草黑脛病菌的抑制作用

選擇初篩效果好的根際細(xì)菌活化后，分別接種于NA培養(yǎng)液中， 37 ℃，180 r/min震蕩培養(yǎng)24 h，5000 r/min離心10 min 收集上清液，將上清液過0.22 μm孔徑的細(xì)菌過濾器后即得到各菌株的無菌代謝液。取2 mL代謝液倒入18 mL OA培養(yǎng)基混勻后制成含代謝液平板，將黑脛病菌菌碟接在平板中央，以不加代謝液的處理為空白對照，4次重復(fù)。

1.2.4 煙草根際細(xì)菌的分子鑒定

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作說明提取基因組。16S rDNA擴增引物為XJR：5′-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3′；XJF：5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′。PCR反應(yīng)體系為： 基因組DNA模板溶液1.0 μL、dNTP 2.0 μL、10×Buffer 2.0 μL、引物XJF 0.5 μL、引物 XJR 0.5 μL、ExTaqDNA PoLymerase 0.5 μL、加ddH2O至20 μL； PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30 cycles；72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物測序由上海生工生物工程有限公司完成。系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建采用DNAMAN軟件。

1.2.5 拮抗菌株大田防效試驗

1)田間試驗設(shè)計及施藥方法。選擇2016年煙草黑脛病重病地自然誘發(fā)，煙草品種為云煙87，育苗后移栽。植煙株距55 cm，行距110 cm。煙苗移栽時，每株灌入100 mL稀釋藥劑，封窩前按同等濃度再灌一次。每處理4次重復(fù)，每重復(fù)植煙50株。試驗處理如下：①YWGJ07按0.5×108cfu/mL灌根處理；②YWGJ07按1.0×108cfu/mL灌根處理；③YWGJ07按2.0×108cfu/mL灌根處理；④100 億/g枯草芽孢桿菌WP(60 g/667m2)灌根處理(對照)；⑤58%甲霜·錳鋅WP(100 g/667 m2)灌根處理(對照)；⑥清水灌根處理(對照)。

2)病害調(diào)查方法。2017年6月20日調(diào)查田間發(fā)病情況。病情分級標(biāo)準(zhǔn)為0級：全株無病；1級：莖部病斑不超過莖圍的三分之一，或三分之一以下葉片凋萎；5級：莖部病斑超過莖圍的二分之一，但未全部環(huán)繞莖圍，或二分之一至三分之二葉片凋萎； 9級：病株基本枯死。發(fā)病率和病情指數(shù)計算公式如下：

發(fā)病率(%) =(發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù))×100%

病情指數(shù)=∑(每級發(fā)病株數(shù)×每級代表值)/(調(diào)查總數(shù)×最高級別代表值)×100

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用DPS 9.50軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草根際細(xì)菌的分離結(jié)果

采用稀釋分離法從煙株根際周圍共分離獲得73株根際細(xì)菌。具體分離數(shù)量、分布地區(qū)詳見表1。

表1 煙草根際細(xì)菌分離結(jié)果

2.2 根際細(xì)菌對煙草黑脛病菌的拮抗作用

2.2.1 貴定縣根際細(xì)菌對煙草黑脛病菌的拮抗作用

由表2可以看出，貴定縣新鋪鄉(xiāng)分離的根際細(xì)菌中，菌株XPGJ05對煙草黑脛病菌的菌絲生長抑制率最高，達到52.7%。貴定縣云霧鎮(zhèn)分離的根際細(xì)菌以YWGJ07對黑脛病菌的菌絲生長抑制率最高，抑制率為51.8%(表3)。

表2 貴定縣新鋪鄉(xiāng)根際細(xì)菌對煙草黑脛病菌的拮抗作用

注：不同的小寫字母表示處理組之間在α =0.05水平上差異顯著(Duncan多重比較法)；下同

Note: The different lowercase show significant difference among treatments at α =0.05 using the Duncan multiple comparisons. The same below

表3 貴定縣云霧鎮(zhèn)根際細(xì)菌對煙草黑脛病菌的拮抗作用

表4 福泉市根際細(xì)菌對煙草黑脛病菌的拮抗作用

2.2.2 福泉市煙草根際細(xì)菌對煙草黑脛病菌的拮抗作用

由表4可知，福泉市陸坪鎮(zhèn)分離的根際細(xì)菌對黑脛病菌的菌絲生長抑制率均在25%以下。福泉市藜山鄉(xiāng)分離的根際細(xì)菌以LSGJ04對黑脛病菌的抑制率最高，抑制率為53.9%。

2.2.3 甕安縣煙草根際細(xì)菌對煙草黑脛病菌的拮抗作用

甕安縣分離的根際細(xì)菌對煙草黑脛病菌的菌絲生長抑制率分布在9.6%～51.2%(表5)。其中，WAGJ07對煙草黑脛病菌的菌絲生長抑制率最高，抑制率為51.2%。

表5 甕安縣根際細(xì)菌對煙草黑脛病菌的拮抗作用

2.2.4 龍里縣煙草根際細(xì)菌對煙草黑脛病菌的拮抗作用

由表6可以看出，龍里縣分離的根際細(xì)菌對煙草黑脛病菌的菌絲生長抑制率分布在4.7%～59.5%。其中，LLGJ04對煙草黑脛病菌的菌絲生長抑制率最大，抑制率為59.5%。

表6 龍里縣根際細(xì)菌對煙草黑脛病菌的拮抗作用

2.3 根際細(xì)菌發(fā)酵液對煙草黑脛病菌菌絲生長的抑制作用

代謝液抑菌試驗結(jié)果顯示(表7)，XPGJ05、YWGJ07、LSGJ04、WAGJ07和LLGJ04對煙草黑脛病菌菌絲生長的相對抑制率均在50%以上，且菌株間的抑制率存在顯著差異。YWGJ07代謝液的抑菌活性最強，菌絲生長抑制率為78.3%。

2.4 拮抗菌的分子鑒定

菌株YWGJ07和LSGJ04經(jīng)PCR擴增后，均檢測到一條大小約1.5 kb的特異性條帶[21]。經(jīng)Blast同源序列比對，菌株YWGJ07和LSGJ04與已經(jīng)報道的貝萊斯芽孢桿菌B.velezensis(MF167634)和B.velezensis(CP011686)的16S rDNA序列有99%的相似性。采用DNAMAN軟件構(gòu)建各菌株16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)，發(fā)現(xiàn)菌株YWGJ07和LSGJ04與貝萊斯芽孢桿菌B.velezensis(MF167634)和B.velezensis(CP011686)的親緣關(guān)系最近，而與假單胞菌屬、泛菌屬和腸桿菌屬各菌株的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。因此，初步鑒定YWGJ07和LSGJ04為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)。

表7 根際細(xì)菌發(fā)酵液對黑脛病菌菌絲生長的抑制效果

2.5 YWGJ07的田間防效

由表8可以看出，YWGJ07按2.0×108、1.0×108、0.5×108cfu/mL灌根、枯草芽孢桿菌WP灌根和甲霜·錳鋅WP灌根對煙草黑脛病的病指防效分別為61.1%、41.1%、38.5%、9.7%和12.2%，其中YWGJ07高、中、低濃度處理的防效均明顯高于生防菌對照和殺菌劑對照。結(jié)果顯示YWGJ07對煙草黑脛病具有潛在的生防價值。

圖1基于16 S rDNA序列的LSGJ04和YWGJ07系統(tǒng)進化樹

處理Treatments病情指數(shù)Disease index防效(%)Control effectsYWGJ07(0.5×108 cfu/mL)27.7 c38.5 bYWGJ07(1.0×108 cfu/mL)26.5 c41.1 bYWGJ07(2.0×108 cfu/mL)17.5 d61.1 a枯草芽孢桿菌WP40.6 b9.7 c甲霜·錳鋅WP39.5 b12.2 c清水對照45.0 a—

3 討論與結(jié)論

根際微生物以細(xì)菌為主，根據(jù)微生物與植物的關(guān)系可分為有害、有益和中性3大類。目前，從植物根際分離篩選益生菌防治植物病害已成為生物防治研究的熱點，其中對植物生長有促進作用、能夠防治植物病害、提高植物產(chǎn)量的一類微生物被稱為植物根際促生菌，主要包括芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)[21-22]。

芽孢桿菌屬是一種常見的植物根際細(xì)菌，具有分布廣、抵抗力強等諸多優(yōu)點。應(yīng)用芽孢桿菌防治植物病害已有很多報道，其生防作用的機制主要包括競爭作用、拮抗作用和誘導(dǎo)抗病性等[23-25]。喬俊卿等[26]證實枯草芽孢桿菌可在接種番茄青枯菌的土壤中定殖，這為番茄青枯病的田間防治提供了重要保障。王進等[13]從煙草根際土壤中分離篩選獲得1株枯草芽孢桿菌，其對煙草黑脛病菌的菌絲生長抑制率為78.33%，對煙草赤星病菌、煙草青枯病菌均具有較強的拮抗作用。本研究從貴州省黔南州貴定、福泉、甕安、龍里等植煙區(qū)黑脛病重發(fā)田塊采集健康煙株的根際土壤，通過稀釋分離法分離獲得73株根際細(xì)菌。經(jīng)對峙培養(yǎng)初篩，細(xì)菌XPGJ05、YWGJ07、LSGJ04、WAGJ07和LLGJ04對黑脛病菌具有較強的拮抗作用。對峙培養(yǎng)試驗中，XPGJ05、YWGJ07、LSGJ04、WAGJ07和LLGJ04對黑脛病菌的菌絲生長抑制率分別為52.7%、51.8%、53.9%、51.2%和59.5%。代謝液抑菌試驗中，XPGJ05、YWGJ07、LSGJ04、WAGJ07和LLGJ04的相對抑制率分別為71.9%、78.3%、68.7%、69.2%和64.3%。結(jié)合對峙培養(yǎng)試驗和代謝液抑菌試驗結(jié)果，篩選獲得煙草黑脛病菌優(yōu)勢拮抗菌株YWGJ07，并初步鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)細(xì)菌。大田防效試驗中，YWGJ07高、中、低濃度處理的防效均明顯高于生防菌對照和殺菌劑對照，這進一步證實YWGJ07對煙草黑脛病有較好的防治效果。