接種根內(nèi)球囊霉提高氮素向甘薯塊根轉(zhuǎn)移和再分配的機(jī)理

張樹海，李 歡，劉 慶，向 丹

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，山東青島 266109）

甘薯是繼水稻、小麥和玉米之后第四大糧食作物，在我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位[1]，氮素是甘薯必需的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素之一，是影響其生長(zhǎng)和產(chǎn)量形成的首要因素。為了節(jié)省勞動(dòng)力并獲得高產(chǎn)，施肥方式多為“一炮轟”，造成肥料利用率很低，效益下降，并對(duì)環(huán)境造成污染[2]。如何保持或改善耕地的土壤質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的穩(wěn)定、可持續(xù)發(fā)展是目前亟待解決的重要問(wèn)題[3]。土壤微生物在養(yǎng)分持續(xù)供給及土壤保持中起著舉足輕重的作用并受到廣泛關(guān)注[4]。

在眾多的土壤微生物中，叢枝菌根(arbuscular mycorrhiza，AM)是分布最為廣泛的菌根類型，地球上80%～90%的被子植物都能形成叢枝菌根[5]。AM真菌能促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，增強(qiáng)寄主植物對(duì)養(yǎng)分特別是氮、磷的吸收與利用[6]。研究發(fā)現(xiàn)甘薯具有很強(qiáng)的菌根依賴性[7-8]。氮作為甘薯生長(zhǎng)的限制性因素[9]，可通過(guò)接種叢枝菌根提高環(huán)境中氮素營(yíng)養(yǎng)的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)[10]。AM真菌可以通過(guò)根外菌絲吸收環(huán)境中的NO3-、NH4+和氨基酸，吸收的氮轉(zhuǎn)運(yùn)給植株，進(jìn)而增強(qiáng)甘薯對(duì)氮素的吸收[11]。不同生育階段的甘薯吸收氮的強(qiáng)度和數(shù)量不同，甘薯在生長(zhǎng)前、中期吸收氮素較多，在塊根膨大的后期仍需要一定量的氮素吸收來(lái)維持地上部源器官的建成[12]。接種AM真菌能夠調(diào)控甘薯T/R值，持續(xù)供給植物氮、磷養(yǎng)分[13]，可緩解因后期氮素供應(yīng)不足而引起的庫(kù)源失衡問(wèn)題[14]。前人研究了菌根促進(jìn)寄主對(duì)土壤中氮素的吸收和同化過(guò)程，而對(duì)氮素在植物體轉(zhuǎn)移和再分配研究較少。

利用同位素示蹤技術(shù)研究甘薯對(duì)氮素的吸收與分配已有大量報(bào)道，大多采用底施15N的方法研究植株對(duì)15N吸收和各器官分配的情況[15-16]，是一種長(zhǎng)期效應(yīng)的反映[17]。由于底施15N的方法不能區(qū)分宿主植物體內(nèi)氮的增加是由AM真菌的直接吸收作用還是由AM真菌侵染引起宿主植物生長(zhǎng)狀況改變的間接作用所導(dǎo)致[18]。本研究在甘薯特定生長(zhǎng)時(shí)期進(jìn)行15N的木質(zhì)部定量注射方法，研究甘薯對(duì)氮素的同化和轉(zhuǎn)移分配，它能夠反映氮素運(yùn)轉(zhuǎn)的瞬時(shí)變化。本試驗(yàn)通過(guò)甘薯不同生育時(shí)期木質(zhì)部注射(15NH4)2SO4，定量分析接種AM真菌對(duì)甘薯氮素轉(zhuǎn)移和再分配的動(dòng)態(tài)影響，研究AM真菌對(duì)甘薯的侵染率及葉片氮代謝酶活性的影響，探索甘薯氮素吸收后在植株體內(nèi)的利用和再分配規(guī)律，為充分利用AM真菌資源提高甘薯產(chǎn)量和品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2018年5月10日至8月10日在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)日光溫室進(jìn)行，溫度保持22～32℃。供試土壤取自0—20 cm耕層土壤，其基礎(chǔ)養(yǎng)分含量為：有機(jī)質(zhì)14.8 g/kg、堿解氮30.9 mg/kg、速效磷21.5 mg/kg、速效鉀47.2 mg/kg。供試甘薯(Ipomoea batatasL.)品種為北方區(qū)主栽品種龍薯9號(hào)(cv.Longshu-9)，選取長(zhǎng)勢(shì)相同的甘薯幼苗定植于營(yíng)養(yǎng)缽中，每盆定植一株。供試菌種為一種根內(nèi)球囊霉Glomus intraradicesBEG141，由北京市農(nóng)林科學(xué)院提供。試驗(yàn)采用250 mm × 320 mm塑料盆作為培養(yǎng)容器，每盆裝入8 kg過(guò)2 mm篩的滅菌土。試驗(yàn)設(shè)接種叢枝菌根真菌(+AM)和不接種叢枝菌根真菌(-AM)兩個(gè)處理，接種菌根真菌的處理加100 g菌劑與土壤混合，不接種的處理加100 g滅菌的菌劑再加入10 mL菌種濾液以保持微生物區(qū)系一致。

參照Yanbo等[19]方法，于移栽后30、60和90 d從甘薯莖蔓頂部往下數(shù)第5片完全展開葉的葉柄與莖蔓交叉處進(jìn)行15N定量注射。注射方法為：每處理選取長(zhǎng)勢(shì)均勻的4株甘薯，用微量注射器在莖蔓木質(zhì)部注射20 μL濃度為3.32 mg/L的99%(15NH4)2SO4(上?；ぱ芯吭禾峁?溶液，每天注射一次，連續(xù)注射3次，15N總注射體積60 μL，總注射量為15N 200 μg/株，注射完成后三天，將每處理標(biāo)記的4株甘薯收獲，收獲后分為莖、葉、纖維根和塊根4部分進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。各處理施用等量的尿素、磷酸二氫鉀和硫酸鉀做底肥，每個(gè)處理4次重復(fù)，完全隨機(jī)排列。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 生物量干重 將植株分為葉、莖蔓、纖維根和塊根四部分，105℃殺青30 min后75℃烘干至恒重。

1.2.2 根系侵染率 稱取0.5 g鮮根，按照Smith等[20]的方法透明、酸化，用曲利苯藍(lán)(Trypan blue)染色，乳酸甘油脫色，然后選取30條根段，制片，鏡檢。

1.2.3 樣品15N豐度 樣品磨碎過(guò)篩后在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院穩(wěn)定性同位素實(shí)驗(yàn)室用質(zhì)譜儀(Delta Plus；Thermo Electron Corp.，San Jose，CA)測(cè)定。

1.2.4 硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶和谷氨酸脫氫酶活性 取第5片完全展開葉，參照Lin等[21]和Zhang等[22]的方法測(cè)定。

1.3 計(jì)算公式

Ndff(%)=(樣品15N豐度% -15N自然豐度)/(硫酸銨15N豐度% -15N自然豐度)× 100；

15N 吸收量(μg)= 干重(g)× N 含量(%)× Ndff(%)× 106；

15N分配率=器官15N吸收量/植株總15N吸收量；

注射15N利用率=植株總15N吸收量/植株15N總注射量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用 SPSS(18.0)(SPSS Institute，Inc.，Cary，NC，USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)t檢驗(yàn)比較同一生育期處理間的效應(yīng)差異，F(xiàn)檢驗(yàn)比較不同生育期間的處理效應(yīng)差異，LSD法比較平均數(shù)間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種AM真菌對(duì)甘薯侵染率、生物量和氮素吸收的影響

由表1可以看出，未接種菌根真菌(-AM)的處理菌根侵染率約為2%，可忽略不計(jì)。接種菌根真菌的處理顯著增加了甘薯的侵染率及泡囊豐度、根內(nèi)菌絲豐度等菌根指標(biāo)(P＜0.05)。隨著移栽天數(shù)的增加，叢枝豐度和菌絲豐度增幅變小，而泡囊豐度增幅加大，侵染率顯著增加，最高達(dá)到67%。表明隨著植株生物量的增大，甘薯對(duì)菌根依賴性增強(qiáng)。雙因素分析表明，時(shí)間因素對(duì)根系侵染存在顯著的正交互效應(yīng)(叢枝豐度除外)。

與對(duì)照相比，移栽后30 d，AM處理的甘薯生物量和氮素累積量與對(duì)照差異不顯著(P＜0.05)，移栽60天和90天時(shí)，甘薯地上和地下部生物量和氮素積累量都顯著高于對(duì)照(P＜0.05)。雙因素分析表明，時(shí)間與菌根存在正交互效應(yīng)，時(shí)間因素對(duì)甘薯生物量干重及氮素累積增加的影響大于接種菌根效應(yīng)(P＜0.05)。說(shuō)明隨著侵染強(qiáng)度的增加，菌根的正效應(yīng)逐漸增大(表2)。

2.2 接種AM真菌對(duì)甘薯各器官15N積累量和分配率的影響

甘薯發(fā)根結(jié)薯期(移栽后30天)15N積累量表現(xiàn)為莖蔓＞葉片＞塊根＞纖維根，其中15N 在莖蔓和葉片中的積累量明顯高于塊根和纖維根(P＜0.05)。與CK處理相比，接種AM真菌能提高甘薯各器官中15N積累量，尤其是莖和葉的15N積累量增幅明顯。表明接種AM真菌能顯著提高甘薯地上部器官15N的積累，促進(jìn)源器官的建成(圖1)。

移栽后60天(薯蔓并長(zhǎng)期)，葉片中15N積累量較前一時(shí)期顯著增加，地上部15N積累量明顯高于地下部。接種AM真菌的甘薯，其葉片和莖蔓中15N積累量顯著高于未接種處理(P＜0.05)，同時(shí)塊根中15N積累量也顯著高于未接種處理(P＜0.05)。表明接種AM真菌有利于氮素在甘薯營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和儲(chǔ)藏器官生長(zhǎng)并存時(shí)期向莖、葉運(yùn)輸，同時(shí)也開始向塊根運(yùn)輸。

表1 接種AM真菌后各時(shí)期甘薯的侵染率、泡囊豐度、叢枝豐度和菌絲豐度(%)Table1 Root colonization rate, vesicle frequency, arbuscular frequency and hyphae density of sweet potato plants at different growing stages after arbuscular mycorrhiza inoculation

表2 接種AM真菌處理后不同時(shí)期甘薯的生物量、氮素含量及氮素積累量Table2 Biomass, nitrogen content and nitrogen accumulation of sweet potato at different growing stages after arbuscular mycorrhiza inoculation

薯塊膨大期(移栽后90天)，甘薯纖維根和塊根中15N積累量較30天和60天均顯著增加。與CK相比，接種AM真菌地上部15N積累量顯著降低而塊根15N積累量顯著增加(P＜0.05)。表明接種AM真菌有利于氮素由地上部向塊根的轉(zhuǎn)移，促進(jìn)地下部干物質(zhì)積累。

三個(gè)生長(zhǎng)期在接種AM真菌條件下甘薯各器官15N 分配率存在差異，均表現(xiàn)為莖蔓＞葉＞塊根＞纖維根(圖2)。發(fā)根結(jié)薯期(30 d)和薯蔓并長(zhǎng)期(60 d)，接種菌根處理甘薯莖蔓和葉片的15N分配率均高于對(duì)照處理，差異達(dá)顯著性水平(P＜0.05)。通過(guò)木質(zhì)部注射的15N多分配于地上部，約占總分配率的90%，表明接種AM真菌有利于提高地上部15N分配率。薯塊膨大期(90 d)，接種AM真菌后塊根和纖維根中15N分配率較前兩個(gè)時(shí)期顯著上升，而葉片中15N分配率逐漸降低，表明氮素開始主要向塊根轉(zhuǎn)移。

圖1 不同取樣期接種AM真菌后甘薯各器官中15N的積累量Fig.1 15N accumulations in sweet potato organs in different days affected by AM inoculation

圖2 接種AM真菌后不同取樣時(shí)期甘薯各器官中15N的分配率Fig.2 15N allocation rate in sweet potato organs in different days affected by AM fungi inoculation

2.3 接種AM真菌對(duì)甘薯氮代謝酶活性的影響

移栽后30 d，接種菌根真菌顯著提高了甘薯葉片谷氨酸脫氫酶(GDH)和谷氨酰胺合成酶(GS)活性(P＜0.05)，硝酸還原酶(NR)和谷氨酸合成酶(GOGAT)活性沒(méi)有顯著變化。移栽后60 d，接種菌根顯著提高了GDH、GS和GOGAT酶活性，葉片中15N積累量較前一時(shí)期顯著增加。移栽后90天，與不接種處理相比，接種菌根顯著提高了4種氮代謝酶活性(P＜0.05)，GDH、GS和GOGAT酶活性增幅分別為16.8%、28.7%和34.3%，其中GDH和GS酶活性較前兩個(gè)時(shí)期顯著增加，NR和GOGAT酶活性較其他時(shí)期無(wú)顯著性變化。雙因素分析表明，不同生育期與接種菌根真菌的交互作用對(duì)甘薯葉片中GDH和GS酶活性有顯著效應(yīng)(P＜0.05，表3)。

接種菌根真菌提高了甘薯氮代謝酶活性，改變了氮在甘薯體內(nèi)的轉(zhuǎn)移和分配。接種AM真菌的甘薯，其葉片和莖蔓中15N積累量顯著高于未接種處理，同時(shí)塊根中15N積累量也顯著高于未接種處理(P＜ 0.05)。表明接種AM真菌有利于氮素在甘薯營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和儲(chǔ)藏生長(zhǎng)并存時(shí)期向莖、葉運(yùn)輸，同時(shí)也開始向塊根運(yùn)輸。移栽后90 d，甘薯纖維根和塊根中15N積累量較30 d和60 d均顯著增加。與未接種AM真菌相比，接種AM真菌處理地上部15N積累量顯著降低而塊根15N積累量顯著增加(P＜0.05)。表明接種AM真菌有利于氮素由地上部向塊根的轉(zhuǎn)移，促進(jìn)地下部干物質(zhì)積累。

3 討論

甘薯產(chǎn)量的形成取決于庫(kù)源關(guān)系的調(diào)控，促進(jìn)碳、氮同化物向甘薯塊根轉(zhuǎn)運(yùn)是甘薯獲得高產(chǎn)的關(guān)鍵[23]。本研究表明，接種AM真菌對(duì)甘薯不同生育期氮素轉(zhuǎn)移和分配的影響存在差異。AM真菌在發(fā)根結(jié)薯期(前期)能顯著提高15N向葉片轉(zhuǎn)移速率(P＜0.05)，葉片15N積累量比CK處理分別提高了44%和17%。薯蔓并長(zhǎng)期(中期)除能顯著提高15N向葉片轉(zhuǎn)移速率外，同時(shí)也開始比對(duì)照顯著提高15N向塊根轉(zhuǎn)移速率(P＜0.05)。而薯塊膨大期(后期)，接種AM真菌顯著降低15N向葉片中轉(zhuǎn)移量，向塊根的轉(zhuǎn)移量顯著提高(P＜0.05)。甘薯發(fā)根結(jié)薯期和薯蔓并長(zhǎng)期是庫(kù)源關(guān)系建立初期，地上部需不斷增加源規(guī)模以滿足生長(zhǎng)后期塊根膨大所需，此時(shí)代謝中心是甘薯的地上部[24]。接種AM真菌能夠維持較高的凈光合速率并提高氮代謝酶活性，增加葉片中氮代謝同化力[25]，較高的氮代謝速率導(dǎo)致注射的15N優(yōu)先分配到地上部葉片中，這與李忠武等[26]的研究結(jié)果類似。薯塊膨大期，地上部光合產(chǎn)物開始向塊根轉(zhuǎn)移，此時(shí)塊根成為新的代謝中心[27]。薯塊膨大期接種的菌根促進(jìn)了氮素向地下部“庫(kù)”轉(zhuǎn)移，增加塊根中15N積累量及分配率。這與汪順義等[17]的研究結(jié)果類似。因此，接種AM真菌可提高塊根對(duì)15N的征調(diào)能力，加速地上部積累氮素向地下部轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而增加儲(chǔ)藏(產(chǎn)量)器官中的干物質(zhì)積累。

表3 接種AM真菌后甘薯葉片不同生長(zhǎng)時(shí)期NR、GDH、GS、GOGAT酶活性Table3 Activity of NR, GDH, GS and GOGAT in sweet potato leaves at different growing stages affected by AM inoculation

氮代謝是甘薯體內(nèi)最為重要的代謝之一，氮素在甘薯內(nèi)的積累與分配受到氮代謝中關(guān)鍵酶的調(diào)控。無(wú)機(jī)氮在植物體內(nèi)的同化方式主要是通過(guò)GS—GOGAT途徑，其中硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶是兩個(gè)重要的限速酶[28-29]。AM真菌與植物形成共生體在一定程度上影響了植物的代謝系統(tǒng)，接種AM真菌通常會(huì)改變植物地上部NR和GS的活性[30]。Azcon和Tobar[31]研究發(fā)現(xiàn)接種集球囊霉(Glomus fasciculatum)可顯著提高洋蔥地上部的NR和GS活性。本研究發(fā)現(xiàn)，在甘薯不同的生育期接種AM真菌均能提高NR、GDH、GS和GOGA活性。表明通過(guò)接種AM真菌，能夠促進(jìn)甘薯植株內(nèi)無(wú)機(jī)氮向有機(jī)氮的轉(zhuǎn)化，增加植株內(nèi)氨基酸和蛋白類物質(zhì)的積累。另外，根內(nèi)球囊霉(G. intraradices)的根外菌絲中含有谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶，Jin[32]等利用氣相色譜法/質(zhì)譜法、高性能液相色譜法發(fā)現(xiàn)AM真菌在根外菌絲體內(nèi)能夠合成硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶。因此，菌根真菌通過(guò)直接作用和間接作用促進(jìn)了氮素在甘薯體內(nèi)的代謝[33]。

4 結(jié)論

接種AM真菌可以改善甘薯的營(yíng)養(yǎng)狀況，提高甘薯葉片中氮代謝酶活性，從而促進(jìn)甘薯植株內(nèi)無(wú)機(jī)氮向有機(jī)氮的轉(zhuǎn)化，同時(shí)也提高了塊根對(duì)15N的征調(diào)能力，加速地上部積累氮素向地下部轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而增加產(chǎn)量器官中的干物質(zhì)積累。