煙草纈氨酸對(duì)主流煙氣成分的貢獻(xiàn)

申麗霞，郭吉兆，田海英，王紅霞，許淑紅，洪金華，邱建華*

1.中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)楓楊街2 號(hào) 450001

2.浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司寧波卷煙廠，浙江省寧波市奉化區(qū)葭浦西路2001 號(hào) 315040

3.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，鄭州經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)第三大街9 號(hào) 450016

氨基酸是煙草中一類重要的含氮化合物，與煙葉品質(zhì)密切相關(guān)［1-3］。卷煙燃吸時(shí)，氨基酸熱解或參與美拉德反應(yīng)產(chǎn)生部分煙氣成分［4］，研究煙草氨基酸對(duì)煙氣的影響對(duì)于調(diào)控卷煙煙氣成分具有重要意義。許多研究采用高溫?zé)峤鈱?shí)驗(yàn)?zāi)M卷煙燃吸，根據(jù)熱解產(chǎn)物推測(cè)氨基酸對(duì)卷煙煙氣成分的影響，結(jié)果表明氨基酸熱解可產(chǎn)生氰化氫、腈類、氨、吡啶類、吡咯類和吡嗪類等含氮化合物［5-7］。共存基質(zhì)對(duì)氨基酸熱解產(chǎn)物的種類、相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有顯著影響［8-9］，如：葡萄糖可促進(jìn)天冬酰胺熱解時(shí)氰化氫的生成、抑制氨的形成［10］；果糖和脯氨酸共熱解產(chǎn)生1-羥基丙酮、吡咯烷、1-甲酰基吡咯烷、1-乙?；量┩榈葐为?dú)熱解時(shí)不產(chǎn)生的化合物［11］。卷煙燃吸時(shí)多種組分共存，且卷煙燃吸時(shí)溫度、氣氛條件變化復(fù)雜，簡(jiǎn)單熱解條件下所得熱解產(chǎn)物與卷煙實(shí)際燃燒產(chǎn)生的有較大差異［12］。以同位素標(biāo)記化合物進(jìn)行卷煙添加，考察煙氣中同位素標(biāo)記成分的分布，不但可以使化合物熱解條件與卷煙正常燃吸基本一致，同時(shí)由于同位素標(biāo)記產(chǎn)物檢測(cè)的高選擇性，可采用較低的添加水平，避免對(duì)卷煙基質(zhì)造成顯著影響［13-14］。

纈氨酸在烤煙煙葉中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可高達(dá)769 μg/g［15］，是烤煙煙葉中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較大的氨基酸。同時(shí)，纈氨酸也被國(guó)外煙草行業(yè)用作煙草添加劑［16］。本研究中以烤煙型卷煙為基質(zhì)，通過(guò)在煙絲中添加13C5-15N-纈氨酸，采用GC/MS 法進(jìn)行煙氣分析，明確主流煙氣中與纈氨酸相關(guān)的化學(xué)成分并確定量效關(guān)系，旨在明確纈氨酸對(duì)卷煙品質(zhì)影響的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

烤煙煙絲（產(chǎn)地：遵義；等級(jí)：C3F；年份：2016），該煙絲纈氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為325 μg/g；卷煙空筒［圓周：24.1 mm；長(zhǎng)度：（24+60）mm；無(wú)濾嘴通風(fēng)］。

13C5-15N-纈氨酸（98%，美國(guó)Sigma 公司）；D-(+)-葡萄糖、L-纈氨酸（99%，百靈威科技有限公司）；乙酸苯乙酯（98%，英國(guó)Alfa Aesar 公司）；二氯甲烷（色譜純，美國(guó)Avantor 公司）；甲醇（色譜純，美國(guó)Dikma 公司）；苯-d6（99.5%，美國(guó)CIL公司）。

SM450-PC107 直線型吸煙機(jī)（英國(guó)Cerulean 公司）；5250T 熱解儀（美國(guó)CDS 公司）；7890B/5977A氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent 公司）；CPA225D 電子天平（感量0.000 01 g，德國(guó)Sartorius公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

稱取60 g 煙絲樣品，在相對(duì)濕度（60±2）%、溫度（22±1）℃的環(huán)境中平衡48 h。稱取為煙絲實(shí)際質(zhì)量分?jǐn)?shù)4 倍的13C5-15N-纈氨酸，將其溶解于6.0 g 水中，然后將氨基酸溶液均勻噴灑于煙絲上。將上述煙絲樣品裝入自封袋，密封，平衡40 min；然后將其于110 ℃的烘箱中干燥2 min。將烘后的煙絲裝入自封袋中，密封后冷卻至室溫，得到添加量為煙絲實(shí)際質(zhì)量分?jǐn)?shù)4 倍的同位素標(biāo)記氨基酸煙絲樣品。對(duì)照煙絲樣品以空白煙絲添加同樣量的水，采用相同的處理方式制作。

將煙絲置于相對(duì)濕度（60±2）%、溫度（22±1）℃的環(huán)境中平衡48 h，手工卷制成煙支。每組樣品中挑選吸阻范圍為（平均值±49）Pa 和質(zhì)量范圍為（平均值±0.015）g 的煙支作為測(cè)試煙支。

1.2.2 煙氣成分分析

煙氣分析參考文獻(xiàn)［14］的方法。按照ISO 標(biāo)準(zhǔn)條件［17］抽吸卷煙，采用44 mm 劍橋?yàn)V片、串聯(lián)兩個(gè)含有10 mL 甲醇的吸收瓶進(jìn)行煙氣粒相和氣相成分捕集。卷煙抽吸結(jié)束后，采用含有內(nèi)標(biāo)（乙酸苯乙酯和氘代苯）的二氯甲烷溶液超聲萃取粒相物，萃取液過(guò)0.45 μm 濾膜，將濾液用GC/MS 法分析煙氣粒相成分。兩個(gè)吸收瓶中分別加入含有相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)內(nèi)標(biāo)的二氯甲烷溶液，各取1 mL 混合后，采用GC/MS 法分析煙氣氣相成分。質(zhì)譜采集采用全掃描監(jiān)測(cè)模式，掃描范圍為25～400 amu。

1.2.3 熱解實(shí)驗(yàn)

分別稱取180 mg 葡萄糖、120 mg 纈氨酸，置入研缽中共研、混合均勻，作為葡萄糖和纈氨酸的混合物（摩爾比約為1∶1）。各稱取0.92 mg 葡萄糖、0.97 mg 纈氨酸以及1.17 mg 葡萄糖-纈氨酸混合物，分別進(jìn)行熱解以及在線GC/MS 分析。熱解條件：

2 結(jié)果與討論

2.1 纈氨酸與卷煙主流煙氣成分的定性關(guān)系

為確定13C5-15N-纈氨酸對(duì)卷煙主流煙氣貢獻(xiàn)的化學(xué)成分，按照不同質(zhì)荷比逐個(gè)疊加對(duì)照樣和13C5-15N-纈氨酸添加的實(shí)驗(yàn)樣色譜圖，疊加離子質(zhì)量數(shù)范圍為30～200 amu，記錄實(shí)驗(yàn)樣與對(duì)照樣相比有增加的離子，并記錄對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間。根據(jù)對(duì)照樣對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間質(zhì)譜圖，采用NIST14 譜庫(kù)定性對(duì)應(yīng)化合物。以2-甲基丙醛為例，對(duì)纈氨酸相關(guān)煙氣成分的定性進(jìn)行方法描述。選擇實(shí)驗(yàn)樣和對(duì)照樣的色譜圖，疊加每個(gè)質(zhì)荷比選擇離子色譜圖（圖1）。在保留時(shí)間14.4 min 處發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照樣相比，實(shí)驗(yàn)樣m/z=76、46、44、29 等離子的豐度大幅增加。表明保留時(shí)間14.4 min 處的化合物與13C5-15N-纈氨酸相關(guān)。

圖1 實(shí)驗(yàn)樣（添加有13C5-15N-纈氨酸）與對(duì)照樣在14.4 min 處疊加色譜圖Fig.1 Overlaying chromatogram of experimental samples(spiked by 13C5-15N-valine)and the control at retention time of 14.4 min

圖2a 為對(duì)照樣14.4 min 處色譜峰的質(zhì)譜圖，以NIST14 譜庫(kù)定性，表明該化合物為2-甲基丙醛。比較對(duì)照樣和實(shí)驗(yàn)樣保留時(shí)間14.4 min 處對(duì)應(yīng)成分的質(zhì)譜圖（圖2）可以發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)樣質(zhì)譜圖中m/z=76、46、44、29 的相對(duì)豐度大幅增加。2-甲基丙醛的分子離子峰為m/z=72，主要碎片離子m/z=43、41 和27，分別對(duì)應(yīng)于［M-HCO］+、［M-CH3O］+和［C2H5］+；實(shí)驗(yàn)樣中m/z=76（72+4）、46（43+3）、44（41+3）和29（27+2）分別對(duì)應(yīng)于這4 個(gè)離子的同位素標(biāo)記離子。因此可以推測(cè)，實(shí)驗(yàn)樣卷煙主流煙氣中增加的2-甲基丙醛為13C4標(biāo)記，4 個(gè)碳原子均來(lái)自纈氨酸分子。

圖2 對(duì)照樣（a）和實(shí)驗(yàn)樣（b）主流煙氣2-甲基丙醛的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra of 2-methylpropanal in mainstream smoke of the control(a)and experimental(b)samples

圖3 是對(duì)照樣和實(shí)驗(yàn)樣主流煙氣中甲基吡嗪（C5H6N2）的質(zhì)譜圖。對(duì)照樣中甲基吡嗪的分子離子峰為m/z=94，m/z=95 對(duì)應(yīng)于天然同位素的分子離子峰。實(shí)驗(yàn)樣中m/z=95 的相對(duì)豐度明顯增加；同時(shí)m/z=68 相對(duì)m/z=67 略有增加。表明實(shí)驗(yàn)樣卷煙主流煙氣中增加了同位素標(biāo)記的甲基吡嗪。

圖3 對(duì)照樣（a）和實(shí)驗(yàn)樣（b）主流煙氣中甲基吡嗪的質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of methylpyrazine in mainstream smoke of the control(a)and experimental(b)samples

圖4 是對(duì)照樣和實(shí)驗(yàn)樣2-環(huán)戊烯-1-酮（C5H6O）的質(zhì)譜圖。對(duì)照樣顯示2-環(huán)戊烯-1-酮的分子離子峰為m/z=82。實(shí)驗(yàn)樣中m/z=85 的離子相對(duì)豐度顯著增加，對(duì)應(yīng)于M+3 的同位素分子離子峰。對(duì)應(yīng)地，實(shí)驗(yàn)樣中m/z=84、55 等離子均比對(duì)照樣略有增加。由此可以推測(cè)，實(shí)驗(yàn)樣卷煙主流煙氣中增加了2-環(huán)戊烯-1-酮，且只有3 個(gè)碳原子來(lái)自纈氨酸。

圖4 對(duì)照樣（a）和實(shí)驗(yàn)樣（b）主流煙氣中2-環(huán)戊烯-1-酮的質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectra of 2-cyclopenten-1-one in mainstream smoke of the control(a)and experimental(b)samples

除了2-甲基丙醛、甲基吡嗪、2-環(huán)戊烯-1-酮外，還發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)樣煙氣中增加了全13C 標(biāo)記的3-甲基丁酸、異丁烷和2-甲基-1-丙烯等，表明纈氨酸對(duì)煙氣中這3 種化合物的形成有一定貢獻(xiàn)。這6 種化合物的分子式、主要質(zhì)譜離子和13C5-15N 標(biāo)記纈氨酸實(shí)驗(yàn)樣質(zhì)譜圖中主要增加的離子見(jiàn)表1。

需要說(shuō)明的是，纈氨酸在卷煙燃吸時(shí)熱解、燃燒可能形成的CO、CO2、氨、氰化氫等小分子成分在本分析方法中均無(wú)法覆蓋。

2.2 纈氨酸與卷煙主流煙氣成分的量效關(guān)系

為了確定纈氨酸與上述6 種化合物的量效關(guān)系，分別選擇非標(biāo)記和同位素標(biāo)記化合物定量離子，以非標(biāo)記定量離子峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值定量對(duì)照樣中各化合物的釋放量；以同位素標(biāo)記定量離子峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的增量定量實(shí)驗(yàn)樣中同位素標(biāo)記化合物的釋放量。依據(jù)添加實(shí)驗(yàn)結(jié)果可估算煙絲中纈氨酸對(duì)煙氣化合物的貢獻(xiàn)率（%）：

表1 與纈氨酸相關(guān)的卷煙煙氣化學(xué)成分Tab.1 Contribution of valine to cigarette smoke components

R=［(Y/A)×C0］/Y0

式中：Y 為實(shí)驗(yàn)樣同位素標(biāo)記化合物釋放量，μg/支；A 為氨基酸添加量，μg/g；C0為煙絲中氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，μg/g；Y0為對(duì)照樣化合物釋放量，μg/支。

纈氨酸對(duì)6 種化合物的估算貢獻(xiàn)率結(jié)果見(jiàn)表2，表2 中實(shí)驗(yàn)樣化合物釋放量為同位素標(biāo)記化合物的釋放量。纈氨酸對(duì)煙氣2-甲基丙醛的貢獻(xiàn)率最大，達(dá)69%；對(duì)3-甲基丁酸、甲基吡嗪、異丁烷、2-甲基-1-丙烯、2-環(huán)戊烯-1-酮的貢獻(xiàn)率均小于5%。

表2 纈氨酸對(duì)卷煙主流煙氣中6 種化合物的估算貢獻(xiàn)率Tab.2 Estimated contribution rates of valine to 6 compounds in mainstream cigarette smoke

2.3 形成機(jī)制

分別對(duì)纈氨酸、葡萄糖和纈氨酸-葡萄糖混合物（摩爾比約為1∶1）進(jìn)行熱解，初步探討纈氨酸促進(jìn)煙氣6 種成分形成的機(jī)制，結(jié)果見(jiàn)表3。纈氨酸熱解產(chǎn)物中檢測(cè)到2-甲基丙醛和2-甲基-1-丙烯，葡萄糖熱解產(chǎn)物中6 種化合物均沒(méi)有檢出，纈氨酸/葡萄糖混合物中檢出2-甲基丙醛、甲基吡嗪、異丁烷和2-甲基-1-丙烯。2-甲基丙醛在纈氨酸熱解產(chǎn)物中歸一化面積達(dá)22.12%，為纈氨酸的主要熱解產(chǎn)物，而且在纈氨酸-葡萄糖混合物的熱解產(chǎn)物中2-甲基丙醛峰面積和歸一化面積均顯著增加，表明葡萄糖的存在促進(jìn)了纈氨酸熱解形成2-甲基丙醛。

纈氨酸單獨(dú)熱解可以通過(guò)分子內(nèi)脫氨、脫CO形成2-甲基丙醛［18］，如圖5 所示。在葡萄糖存在下，纈氨酸可通過(guò)Strecker 降解反應(yīng)形成2-甲基丙醛［19］，即纈氨酸與Maillard 初級(jí)反應(yīng)產(chǎn)物α-二酮反應(yīng)形成Schiff 堿，然后經(jīng)重排、脫羧和水解產(chǎn)生比纈氨酸少一個(gè)碳原子的2-甲基丙醛，如圖6所示。纈氨酸添加至卷煙中，經(jīng)燃燒產(chǎn)生2-甲基丙醛應(yīng)該是兩種機(jī)制共同作用。氨基酸與糖熱解相互作用形成了甲基吡嗪、異丁烷。在熱解產(chǎn)物中并沒(méi)有檢測(cè)到3-甲基丁酸和2-環(huán)戊烯-1-酮，表明這兩種化合物的形成可能與煙草其他基質(zhì)成分相關(guān)。

表3 纈氨酸、葡萄糖及其混合物熱解產(chǎn)物中6 種化合物的峰面積Tab.3 Peak areas of 6 compounds in pyrolysates of valine,glucose,and their mixture

圖5 纈氨酸直接熱解形成2-甲基丙醛的機(jī)理[18]Fig.5 Mechanism of formation of 2-methylpropanal from pyrolysis of valine

圖6 葡萄糖促進(jìn)纈氨酸熱解產(chǎn)生2-甲基丙醛的機(jī)理[19]Fig.6 Mechanism of formation of 2-methylpropanal from pyrolysis of valine in the presence of glucose

2.4 感官作用

以對(duì)照卷煙為空白，分別添加約50、100、200、300、500 μg/g 纈氨酸進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，添加50 μg/g 的纈氨酸對(duì)煙氣感官?zèng)]有明顯影響；隨著纈氨酸添加量增加，煙氣中堅(jiān)果香和烤煙香韻增加，煙氣濃度增加。500 μg/g 添加量的煙氣過(guò)濃、刺激明顯。對(duì)于該煙絲來(lái)說(shuō)，適宜的添加量應(yīng)該在100～300 μg/g 之間。2-甲基丙醛具有甜的、巧克力味，可增加煙氣豐滿度；纈氨酸具有甜的、堅(jiān)果香、烤煙香韻［20］，兩者對(duì)卷煙香氣的影響基本一致。結(jié)合量效關(guān)系研究可以推斷，煙草中纈氨酸對(duì)煙氣香氣的貢獻(xiàn)主要來(lái)自煙氣2-甲基丙醛釋放量的增加。2-甲基丙醛也被用作煙草添加劑［16］，但其沸點(diǎn)僅為64 ℃，在使用過(guò)程中容易散失，因此，可以采用不揮發(fā)的纈氨酸替代2-甲基丙醛作為煙草添加劑。

3 結(jié)論

卷煙添加穩(wěn)定同位素標(biāo)記纈氨酸研究纈氨酸與相關(guān)主流煙氣成分的定性關(guān)系和量效關(guān)系的結(jié)果表明：①纈氨酸與煙氣中2-甲基丙醛、異丁烷、甲基吡嗪、3-甲基丁酸、2-環(huán)戊烯-1-酮和2-甲基-1-丙烯等化合物的形成有關(guān)。②纈氨酸對(duì)2-甲基丙醛的貢獻(xiàn)率最大，達(dá)69%，對(duì)異丁烷、甲基吡嗪、3-甲基丁酸、2-環(huán)戊烯-1-酮、2-甲基-1-丙烯的貢獻(xiàn)率均小于5%。③纈氨酸對(duì)煙氣香氣的影響主要來(lái)自纈氨酸自身熱解和Strecker 降解產(chǎn)生的2-甲基丙醛。