孕產(chǎn)婦外周血胎兒游離DNA比例檢出影響因素分析

陸 平

浙江省安吉縣中醫(yī)醫(yī)院(313300)

在出生缺陷中，染色體異常是最為嚴(yán)重的疾病類型之一，產(chǎn)前檢查是減少非整倍體疾病等出生缺陷最為重要手段[1]。近年，母體外周血中胎兒游離DNA(cfDNA)為出生缺陷檢出提供新的高效方法，檢測準(zhǔn)確率高于傳統(tǒng)血清檢測，且避免了侵入性檢測的不良反應(yīng)。但檢出準(zhǔn)確性與侵入性檢測仍有一定差距，cfDNA比例(FF)是檢測成功重要因素[2]，胎兒游離DNA含量成為影響該技術(shù)檢測敏感性的關(guān)鍵。FF可受多種因素影響，根據(jù)患者特征確定是否行檢測及選擇時間具有重要意義。本研究以接受cfDNA檢測的孕產(chǎn)婦為研究對象，探討孕婦外周血游離FF的影響因素，為胎兒cfDNA檢測提供建議。

1 材料與方法

1.1 研究對象

回顧性收集2014年1月—2017年12月于安吉縣婦幼保健院、安吉縣中醫(yī)院接受無創(chuàng)產(chǎn)前篩查(NIPT)且資料完整、孕有男性胎兒孕婦檢測結(jié)果。納入標(biāo)準(zhǔn)：①孕周10～36周。②單胎妊娠；③孕產(chǎn)婦年齡≥20歲；④孕產(chǎn)婦完成了早孕期常規(guī)產(chǎn)前篩查，包括超聲檢查(頸項透明層厚度、胎兒畸形等)，胎盤生物標(biāo)志物檢測如游離人絨毛膜促性腺激素(β-hCG)，妊娠相關(guān)血漿蛋白A(PAPP-A)等。排除超聲檢測診斷為胎兒畸形者。本次研究納入成功檢測cfDNA孕產(chǎn)婦1235例，年齡(27.4±5.3)(20～42)歲，檢測時體質(zhì)指數(shù)(BMI)(25.5±4.8)kg/m2。

1.2 游離DNA檢測

胎兒經(jīng)超聲評估符合NIPT檢測指征。采集孕婦空腹外周血分離血漿磁珠分離法提取DNA(美國Beckman公司)，采用Hiseq2000(美國Illumina)行高通量測序。對高?；颊哐蛩┐?，確定胎兒是否為非整倍體并定期隨訪。胎兒游離DNA計算：(%chrYmf-%chrYff)/(%chrYam-%chrYff)

其中%chrYmf為孕婦外周血中Y染色體百分比，%chrYff所有孕有男性胎兒孕婦血漿中 Y染色體比例中位數(shù)，%chrYam為健康男性血漿Y染色體比例中位數(shù)[3]。FF<4%為檢測失敗，作為異常報告被排除[4]。

1.3 觀測指標(biāo)

①孕產(chǎn)婦一般信息，包括年齡、接受游離DNA檢測時孕周期、BMI等。②孕檢臨床指標(biāo)，包括孕12～14周頸項透明層厚度(NT)，唐氏篩查游離β-hCG(MoM)、妊娠相關(guān)血漿蛋白A (PAPP-A)(MoM)、胎盤生長因子(PLGF)(MoM)，分析上述指標(biāo)與FF值相關(guān)性。③觀測cfDNA與羊水穿刺診斷非整倍體檢出準(zhǔn)確率，比較真陽性與假陽性胎兒FF值差異。

1.4 統(tǒng)計分析方法

2 結(jié)果

2.1 FF及相關(guān)臨床指標(biāo)

1235例孕產(chǎn)婦中，F(xiàn)F值及各檢測指標(biāo)見表1。

表1 FF值及相關(guān)臨床指標(biāo)

2.2 FF與相關(guān)變量的相關(guān)性

線性回歸分析結(jié)果顯示，F(xiàn)F與孕產(chǎn)婦年齡呈負(fù)相關(guān)(r=-0.184，P<0.001)，見圖1(a)；與檢測時BMI呈負(fù)相關(guān)(r=-0.569，P<0.001)，圖1(b)；與游離β-hCG呈正相關(guān)(r=0.327，P<0.001)，見圖1(c)；與PAPP-A呈正相關(guān)(r=0.512，P<0.001)，見圖1(d)；與孕周呈正相關(guān)(r=0.433，P<0.001)，見圖1(e)；與胎兒NT水平相關(guān)性不存在統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 FF與多元線性回歸

采用多元逐步回歸分析顯示年齡、BMI、孕周及游離β-hCG與FF獨立相關(guān)，其中與BMI呈負(fù)相關(guān)，與孕周、游離β-hCG呈負(fù)相關(guān)。見表2。

2.4 真陽性與假陽性之間FF差異

1235例檢出非整體高風(fēng)險胎兒31例；以羊水穿刺作為金標(biāo)準(zhǔn)確診25例，為非整體假陽性6例。FF平均水平真陽性胎兒高于假陽性，但不同亞型FF值未見差異(P>0.05)，見表3。

表2 FF多元線性回歸

表3 兩種方法篩查的診斷效能

a：與年齡；b：與BMI；c：與游離β-hCG；d：與PAPP-A；e：與孕周圖1 FF值與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討論

目前，并非所有無創(chuàng)產(chǎn)前診斷中均開展了FF檢測，因為其診斷價值仍然存在爭議[5]。研究顯示，檢測FF比例存在檢測失敗風(fēng)險，造成資源浪費，也可能影響孕產(chǎn)婦心理情緒；但放棄FF檢測則可能增加假陰性風(fēng)險[6]。游離DNA的檢測在提高了檢查準(zhǔn)確率的同時具備無創(chuàng)優(yōu)勢，近年得到了大范圍推廣。

如何準(zhǔn)確得出游離DNA比例是實現(xiàn)更高檢測效率的基礎(chǔ)。而游離DNA檢測并非持續(xù)監(jiān)測指標(biāo)，可能受多種因素影響[3]。孕產(chǎn)婦BMI與胎兒游離DNA檢出的關(guān)系已有多個報道[7-9]，孕產(chǎn)婦BMI≤24kg/m2時其FF值平均為12%，而BMI>30kg/m2時其FF值平均為7%。國內(nèi)薛瑩[10]等研究顯示年齡與FF值呈負(fù)相關(guān)。本研究顯示年齡與FF值平均水平相關(guān)，提示隨著孕產(chǎn)婦年齡及BMI增加，cfDNA比例檢出可能會降低，而基于游離DNA的胎兒畸形檢出需要相應(yīng)比例的胎兒游離DNA保障，否則會出現(xiàn)檢測失敗。年齡對cfDNA比例的影響目前國內(nèi)外尚無統(tǒng)一定論，本文推測其相關(guān)性原因為產(chǎn)婦年齡增大、孕期BMI也相對較高，導(dǎo)致cfDNA比例降低。此外，cfDNA比例與孕周成正比，因此對BMI較高的孕產(chǎn)婦延后檢測時間可能會提升cfDNA比例檢測的成功率，但cfDNA比例與孕周的相關(guān)性較弱[8]。因此對于高齡及BMI較高的孕產(chǎn)婦需要提前告知檢測失敗的可能性，同時合理選擇高齡孕產(chǎn)婦檢測時間[7，11-12]。而對檢測失敗的孕產(chǎn)婦超聲檢查則成為至關(guān)重要的檢測工具，醫(yī)師應(yīng)增加其超聲檢測關(guān)注[11]。

本研究顯示，cfDNA比例與β-hCG呈正相關(guān)。β-hCG與PAPP-A等相關(guān)蛋白隨著胎盤增大在母體血清中的含量增加[13]。多數(shù)研究證實，由于非整體或母親疾病的影響，胎盤質(zhì)量可出現(xiàn)降低，上述蛋白在母體外周血中也會對應(yīng)減少[14]，對胎兒異常具有一定指示作用。本研究中cfDNA比例與β-hCG的相關(guān)性可能與胎盤質(zhì)量有關(guān)，低比例的cfDNA與低含量的胎盤生物標(biāo)志物提示胎盤質(zhì)量較小[15]。提示當(dāng)胎盤生物標(biāo)志物較低時，cfDNA檢測失敗的風(fēng)險會對應(yīng)上升；臨床在出現(xiàn)第一次檢測失敗時，如孕產(chǎn)婦合并檢測的胎盤蛋白也處于較低水平，重復(fù)檢測可能性會增加再次失敗，因此應(yīng)根據(jù)情況選擇超聲檢測或侵入性檢查，以保障檢測效能、減少資源浪費。此外，β-hCG與PAPP-A等胎盤蛋白低水平本身可作為不良妊娠結(jié)局的預(yù)測因素，而cfDNA的低比例可提示胎盤異常。

本研究顯示，假陽性中cfDNA比例低于真陽性胎兒。Scott[7]等研究也得出類似結(jié)果，提示cfDNA比例可能影響診斷準(zhǔn)確性，具體原因有待進一步研究。各亞型真陽性與假陽性cfDNA比例均未見差異，可能與本次陽性樣本量較小有關(guān)。21-三體和18-三體異常孕婦外周血中胎兒游離DNA的比例可出現(xiàn)降低，導(dǎo)致檢測失敗，進而出現(xiàn)假陰性，造成漏診；而年齡、BMI的上升可進一步降低胎兒cfDNA檢測成功率，增加漏診風(fēng)險。盡管臨床推薦孕12周后即可進行NITP檢測，但我們認(rèn)為其檢測時間可適當(dāng)延后，尤其是對年齡>35歲，孕中期前期BMI>26kg/m2孕婦，應(yīng)將NITP時間延遲到17～18周[7]。如孕產(chǎn)婦必須在早期進行非整倍體檢測，可考慮采用血清學(xué)風(fēng)險評估與絨毛核型分析等方式結(jié)合。對cfDNA檢測失敗孕產(chǎn)婦，應(yīng)評估其BMI、年齡及游離β-hCG水平，確定有無重復(fù)檢測的必要。

綜上，胎兒游離DNA的檢測成功率及檢出效果與孕周、BMI、胎盤蛋白等因素相關(guān)，應(yīng)根據(jù)孕產(chǎn)婦特征選擇合適的檢測時間；當(dāng)檢測失敗時應(yīng)根據(jù)上述指標(biāo)選擇合適的檢測方法，保障檢測的準(zhǔn)確性。