耕層土層交換對(duì)土壤氮素關(guān)鍵轉(zhuǎn)化過(guò)程和玉米氮素利用的影響*

楊 碩, 金文俊, 黃海蒙, 王 軍, 周得寶, 趙陽(yáng)陽(yáng), 董召榮, 宋 賀**

耕層土層交換對(duì)土壤氮素關(guān)鍵轉(zhuǎn)化過(guò)程和玉米氮素利用的影響*

楊 碩1, 金文俊1, 黃海蒙1, 王 軍1, 周得寶2, 趙陽(yáng)陽(yáng)1, 董召榮1, 宋 賀1**

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 合肥 230036; 2. 宿州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 宿州 234000)

翻耕會(huì)使耕層土壤發(fā)生顯著位置交換。耕層土壤位置交換會(huì)通過(guò)影響土壤物理、化學(xué)和生物性狀, 改變氮素轉(zhuǎn)化過(guò)程。本文研究了土層交換對(duì)黃淮海平原南端砂姜黑土硝化、反硝化過(guò)程和玉米生長(zhǎng)及氮素利用的影響, 為該區(qū)域選擇合理的耕作方式、減少氮素?fù)p失及提高氮素利用效率提供理論依據(jù)。試驗(yàn)在人工氣候室條件下, 以土壤(0~35 cm)田間原位分層作為常規(guī)土層處理(CK), 以原位0~10 cm和10~20 cm土層交換后作為土層交換處理(SE), 并用20 μm的尼龍網(wǎng)區(qū)分非根際和根際土壤。于玉米小喇叭口期利用熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定土壤氨氧化微生物和反硝化菌群豐度, 并結(jié)合非根際和根際土壤的硝化潛勢(shì)、土壤呼吸、反硝化能力、反硝化潛勢(shì)、土壤理化性質(zhì)和玉米總氮含量及根系形態(tài)的測(cè)定, 探討土層交換對(duì)土壤氮素轉(zhuǎn)化和玉米生長(zhǎng)及氮素利用的影響。結(jié)果顯示, SE處理的玉米植株氮吸收量比CK處理顯著降低8.9%(<0.05)。土層交換顯著影響根際而不是非根際土壤的硝化潛勢(shì), 使其顯著降低13.5%(<0.05); 并使非根際和根際土壤的反硝化能力分別提高36.6%(<0.05)和8.4%(<0.05)。土層交換使非根際和根際土壤的可溶性有機(jī)碳含量分別提高11.7%(<0.05)和5.2%。相關(guān)分析顯示硝化潛勢(shì)與氨氧化細(xì)菌(AOB)豐度呈顯著正相關(guān)(=0.91**), 與氨氧化古菌(AOA)豐度無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系; 反硝化能力與土壤可溶性有機(jī)碳和呼吸速率呈顯著正相關(guān)(=0.89**和0.93**), 與、拷貝數(shù)無(wú)顯著相關(guān)性; 玉米植株氮吸收量與根際土壤的硝化潛勢(shì)、根表面積×AOB拷貝數(shù)都呈顯著正相關(guān)(=0.83*和0.86*), 而與反硝化能力呈顯著負(fù)相關(guān)(=-0.88**)。以上結(jié)果表明砂姜黑土土壤硝化速率的降低和反硝化速率的增強(qiáng), 是土層交換后玉米氮素利用效率低的重要原因。AOB是硝化速率的主要驅(qū)動(dòng)微生物。土層交換后土壤可溶性有機(jī)碳是反硝化能力的關(guān)鍵主導(dǎo)因子。在翻耕條件下, 有效調(diào)節(jié)土壤可溶性有機(jī)碳含量是提高作物氮肥利用效率的關(guān)鍵。

土層交換; 玉米; 根際; 硝化; 反硝化; 氮素利用

氮素轉(zhuǎn)化是土壤養(yǎng)分循環(huán)的重要組成部分, 不僅影響土壤質(zhì)量, 還會(huì)對(duì)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力和持續(xù)性產(chǎn)生影響[1]。硝化和反硝化是土壤氮素轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵過(guò)程[2]。硝化過(guò)程是NH3在好氧微生物作用下氧化成NO2-, 隨后再氧化成NO3-的過(guò)程。NH3氧化成NO2-是該過(guò)程的限速步驟, 由氨氧化細(xì)菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)共同推動(dòng)[3-4]。反硝化過(guò)程則是把NO3-和NO2-作為微生物電子受體, 在無(wú)氧或微氧條件下, 經(jīng)過(guò)多種酶催化逐步還原為氣態(tài)產(chǎn)物(NO、N2O和N2)的過(guò)程。其中, 亞硝酸還原酶將水溶態(tài)氮轉(zhuǎn)化成作物無(wú)法利用的氣態(tài)氮, 是土壤氮素?fù)p失的關(guān)鍵過(guò)程, 由和基因編碼[5-6]。

硝化和反硝化過(guò)程受到土壤含氧量、有機(jī)碳和無(wú)機(jī)氮等環(huán)境因素的調(diào)控[7-10]。例如氧分壓的增加會(huì)促進(jìn)硝化過(guò)程, 而反硝化過(guò)程在厭氧條件下更加有利于氮素轉(zhuǎn)化成氣態(tài)產(chǎn)物[11]。有機(jī)碳富集會(huì)刺激細(xì)菌的生長(zhǎng), 增加土壤呼吸和氮同化需求, 加劇氨氧化菌與需氮異養(yǎng)微生物對(duì)銨和氧的競(jìng)爭(zhēng), 不利于硝化過(guò)程; 相反, 有機(jī)碳作為反硝化微生物的電子供體和細(xì)胞能源物質(zhì), 且其分解過(guò)程中消耗了土壤中的氧利于營(yíng)造厭氧環(huán)境, 會(huì)直接或間接地促進(jìn)反硝化過(guò)程[12-14]。硝態(tài)氮和銨態(tài)氮是土壤無(wú)機(jī)氮的主要存在形式。在沒(méi)有其他環(huán)境因素制約的情況下, 一定范圍內(nèi)無(wú)機(jī)氮濃度的升高會(huì)加快硝化和反硝化過(guò)程。其中, 硝態(tài)氮作為反應(yīng)底物會(huì)直接影響反硝化過(guò)程; 而銨態(tài)氮也會(huì)促進(jìn)硝化過(guò)程, 并對(duì)AOB和AOA的豐度和群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[15-16]。

土壤耕作是作物生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié), 通過(guò)機(jī)械物理作用, 調(diào)節(jié)耕層土壤內(nèi)部位置和物理結(jié)構(gòu), 會(huì)對(duì)土壤水、肥、氣、熱等環(huán)境條件產(chǎn)生顯著影響[17-18]。翻耕可使耕層土壤發(fā)生顯著的位置交換, 使下層土壤被翻到表層后變得疏松, 可能會(huì)促進(jìn)硝化過(guò)程; 而上層土壤被翻到底層后會(huì)使大孔隙的體積減少, 造成土壤的空氣和透氣性降低。且上層土壤的有機(jī)碳和底物氮含量較高, 在被翻到底層后, 可能為反硝化過(guò)程創(chuàng)造了更好的環(huán)境條件。耕層土壤的位置交換會(huì)深刻改變上、下兩層土壤的觸氧面和微生物的生長(zhǎng)環(huán)境, 同時(shí)也引起耕層土壤理化性狀的改變。耕層土層交換后的這些改變與作物根系之間會(huì)產(chǎn)生相互作用, 改變根際的氮素轉(zhuǎn)化過(guò)程, 并可能對(duì)作物的氮素吸收產(chǎn)生影響。但是, 目前關(guān)于耕層土壤氮素關(guān)鍵轉(zhuǎn)化過(guò)程的改變對(duì)玉米()植株吸氮有何影響的研究鮮有報(bào)道。本研究假設(shè): 相比常規(guī)土層, 土層交換可能會(huì)降低耕層土壤的硝化作用, 但會(huì)促進(jìn)反硝化作用。由于反硝化作用會(huì)增加土壤有效態(tài)氮的損失, 作物對(duì)氮素的吸收可能會(huì)減少。

黃淮海平原是我國(guó)糧食的主產(chǎn)區(qū), 約占全國(guó)耕地面積的1/6, 其玉米產(chǎn)量占全國(guó)總產(chǎn)的35%~ 40%[19]。本試驗(yàn)選擇黃淮海平原南部典型的砂姜黑土作為供試土壤, 在人工氣候室中用根箱培養(yǎng)玉米。利用分子微生物學(xué)和生物化學(xué)等方法, 重點(diǎn)研究土層交換對(duì)土壤氮素轉(zhuǎn)化和玉米生長(zhǎng)及氮素利用的影響, 并通過(guò)土壤理化性狀、氮素轉(zhuǎn)化過(guò)程及氮素關(guān)鍵轉(zhuǎn)化微生物豐度的分析, 剖析其中的機(jī)理過(guò)程, 為該區(qū)域選擇合理的耕作方式、減少氮素?fù)p失及提高氮素利用效率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)土壤取自安徽省宿州市安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)皖北綜合試驗(yàn)站(33°41′N(xiāo), 117°04′E), 為黃淮海平原南部典型的砂姜黑土。0~20 cm土層土壤基礎(chǔ)理化性狀: 有機(jī)質(zhì)18.8 g?kg-1, 全氮1.3 g?kg-1, 堿解氮96.5 mg?kg-1, 全磷0.9 g?kg-1, 全鉀20.7 g?kg-1, 有效磷3.1 mg?kg-1, 速效鉀200.0 mg?kg-1, pH 7.9, 容重1.4 g?cm-3。

分3層(0~10 cm、10~20 cm、20~35 cm)挖取的大田土壤, 在室內(nèi)過(guò)2 mm篩并混勻后置于陰涼處晾干, 分層放入一組根箱(長(zhǎng)45 cm、寬3.5 cm、高35 cm)中, 并保證土壤的上、中、下位置順序及容重與田間原位相同, 將此組作為常規(guī)土層處理(CK, 圖1)。把0~10 cm和10~20 cm土層, 分別視作A和B層土壤(圖1)。將原位A層和B層分別放入另外一組根箱的10~20 cm和0~10 cm處, 20~35 cm土層土壤仍按照田間原位填充, 該組視做土層交換處理(SE, 圖1)。根箱由20 μm的尼龍網(wǎng)分成3個(gè)隔室(中央隔室長(zhǎng)為15 cm, 外側(cè)隔室長(zhǎng)為15 cm, 寬和高均為3.5 cm×35 cm)以使根系不能通過(guò), 中央隔室為根際土壤, 而外側(cè)隔室則為非根際土壤[20]。本研究土層交換為主因素, 根際和非根際土壤為2種副因素, 共4個(gè)處理, 每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。

根箱置于充滿細(xì)沙的托盤(pán)(重力水位滿足在沙層上1 mm水平)上, 轉(zhuǎn)移至人工氣候室(35 ℃光照14 h/25 ℃黑暗10 h循環(huán)交替, 空氣濕度70%), 并在培養(yǎng)過(guò)程中往根箱中加水保持土壤含水量(WFPS)為40%~60%。待土壤穩(wěn)定后, 在中央隔室播種2粒‘鄭單958’玉米種子, 在三葉期間苗, 每個(gè)根箱留玉米苗1株。從玉米播種時(shí)起, 每周向根箱中加入KNO3和KH2PO4溶液, 4周后土壤累積施入的氮素含量達(dá)到每公頃120 kg, 磷素含量達(dá)到每公頃50 kg。

圖1 不同處理(常規(guī)土層、土層交換)玉米-根箱裝置

1.2 樣品采集

玉米出苗后第5周, 對(duì)根箱中土壤和玉米植株樣品進(jìn)行破壞性取樣。從根系密集的中央隔室中分層取出土壤并仔細(xì)去除與土壤黏附根系, 收集起來(lái)作為根際土壤; 非根際土從兩側(cè)隔室分層收集。隨后將收集好的土壤裝入帶有冰袋的保溫箱中, 帶回實(shí)驗(yàn)室。已采集的根際土壤和非根際土壤樣品在過(guò)2 mm篩并混勻后, 根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目進(jìn)行如下分裝與貯藏: 其中200 g放在–20 ℃冰箱中, 主要用于硝化和反硝化功能基因分子定量試驗(yàn)和無(wú)機(jī)氮、可溶性碳氮與pH等土壤化學(xué)性狀的測(cè)定; 300 g保存于4 ℃冰箱中, 進(jìn)行土壤呼吸、反硝化能力、反硝化潛勢(shì)和硝化潛勢(shì)的測(cè)定。同時(shí), 玉米的地上部植株和根系用自來(lái)水沖洗掉殘余土壤后, 收集起來(lái)用于玉米組織的分析。

1.3 玉米組織的分析

玉米出苗后第5周, 在破壞性取樣前采用手持式葉綠素儀(SPAD 502, 日本)測(cè)定根箱中玉米葉片葉綠素含量(SPAD)。檢測(cè)時(shí)選取玉米最上部完全展開(kāi)葉, 并以葉片的葉尖、中間和靠近莖部位的平均讀數(shù)來(lái)代表葉片葉綠素含量。之后, 玉米葉片在1 500 μmol?m-2?s-1光合有效輻射的紅色/藍(lán)色LED源、葉室溫度25 ℃、葉-氣蒸汽壓力差(1.7±0.1) kPa和環(huán)境CO2濃度條件下用光合速率儀(LI-6400, 美國(guó))檢測(cè)。測(cè)定完成后, 分地上部和地下部取出整株玉米, 用于測(cè)定根系形態(tài)和全氮含量。先把待測(cè)的根際土壤從中央隔室分層取出, 將其置于篩子中用清水反復(fù)沖洗至根系與土壤分離, 已篩選出的根系采用WINRHIZO根系分析系統(tǒng)測(cè)定根長(zhǎng)、根表面積、根平均直徑、根體積和根尖數(shù)等根系形態(tài)指標(biāo)。玉米地上部和地下部樣品在烘箱中105 ℃殺青15 min, 80 ℃恒溫烘干, 粉碎并過(guò)篩后, 采用硫酸-雙氧水消煮, 凱氏定氮法測(cè)定樣品全氮含量。

1.4 土壤理化性質(zhì)的分析

對(duì)玉米出苗后第5周從根箱中收集的根際和非根際土壤進(jìn)行土壤化學(xué)性質(zhì)的分析。土壤硝態(tài)氮(NO3--N)和銨態(tài)氮(NH4+-N)含量采用連續(xù)流動(dòng)分析儀(AA3, 德國(guó))測(cè)定。鮮土置于燒杯中, 加入浸提液, 磁力攪拌器攪拌30 min, 靜置或離心后, 獲取的濾液置于冰箱中貯藏。硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的浸提液為1 mol·L-1KCl溶液(水土比5∶1)。可溶性有機(jī)碳(DOC)和有機(jī)氮(DON)含量采用Multi 3100 C/N分析儀(Jena Analytik, 德國(guó))檢測(cè)。DOC和DON測(cè)定選用0.5 mol·L-1K2SO4溶液(水土比2.5∶1)做為浸提液。土壤pH的測(cè)定采用pH計(jì)(STARTER, 3100)電位計(jì)法(水土比5∶1)。

1.5 硝化潛勢(shì)的測(cè)定

硝化潛勢(shì)(NP)的測(cè)定采用懸浮液法[21]。先稱(chēng)量5 g鮮土樣品于120 mL血清瓶中, 然后加入1.5 mmol?L-1NH4+的液體培養(yǎng)基(水土比10∶1), 置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱(30 ℃, 200 r?min-1)中培養(yǎng)2 d。培養(yǎng)期間, 每間隔12 h取樣一次, 共獲得5份液體樣品。每次取樣量為4 mL, 懸浮液離心后, 將取得的上清液置于冰箱中貯藏, 連續(xù)流動(dòng)分析儀(AA3, 德國(guó))檢測(cè)。硝化潛勢(shì)按NO3--N、NO2--N在單位時(shí)間內(nèi)形成的總量來(lái)計(jì)算。

1.6 反硝化作用和土壤呼吸的測(cè)定

反硝化能力和反硝化潛勢(shì)的測(cè)定參考?imek等[22]和Yeomans等[23]的方法。反硝化能力(DC)和反硝化潛勢(shì)(DP)是以單位時(shí)間內(nèi)N2O+N2的產(chǎn)生率來(lái)表示, 土壤呼吸(SR)是根據(jù)CO2氣體變化率計(jì)算。簡(jiǎn)要的試驗(yàn)步驟: 各樣品稱(chēng)取兩份10 g鮮土放入120 mL血清瓶, 隨后加入42.9 mmol?L-1KNO3溶液5 mL。加蓋密封后反復(fù)用真空泵抽真空-氦氣清洗3~4次, 并使瓶?jī)?nèi)處于厭氧狀態(tài)。向其中一組血清瓶中注入10 mL乙炔進(jìn)行培養(yǎng), 其N(xiāo)2O氣體變化率代表了單位時(shí)間內(nèi)反硝化總量(N2O+N2)的產(chǎn)生率。另一組不添加乙炔培養(yǎng)的血清瓶中CO2氣體變化率表征土壤呼吸。用裝有少量水、沒(méi)有活塞的注射器插入瓶塞來(lái)平衡瓶?jī)?nèi)氣壓后, 將血清瓶置于人工氣候箱恒溫25 ℃條件下培養(yǎng)。在培養(yǎng)24 h和48 h后, 用注射器從血清瓶中抽取5 mL氣體樣品, 并立即用氣相色譜儀(GC-7890A, 美國(guó))檢測(cè)N2O和CO2濃度。反硝化潛勢(shì)(DP)的測(cè)定, 除用含42.9 mmol?L-1KNO3外, 另外添加8.3 mmol?L-1葡萄糖, 其他試驗(yàn)步驟同反硝化能力的測(cè)定。

1.7 土壤微生物總DNA提取和功能基因熒光定量

土壤微生物總DNA提取按照DNA提取試劑盒(Fast DNASPIN Kit for Soil, 美國(guó)Q-BIO gene公司)提供的操作步驟進(jìn)行。稱(chēng)取0.5 g土壤樣品, 用試劑盒提取后獲得80 μL DNA樣品并立即貯藏于–20 ℃冰箱中。采用Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(Stratagene, USA)對(duì)氨氧化細(xì)菌和古菌的功能基因進(jìn)行定量PCR, 選擇的PCR反應(yīng)體系(25 μL)包括12.5 μL的2×SG Green qPCR Mix, 0.5 μL的DNA模板和上下游引物各0.5 μL(10 μmol?L-1), 其余的用無(wú)菌水補(bǔ)齊。氨氧化細(xì)菌的擴(kuò)增引物選用/[24], PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min; 35個(gè)循環(huán): 95 ℃變性30 s, 57 ℃退火30 s, 72 ℃延伸60 s。氨氧化古菌擴(kuò)增引物選用/[25], PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min; 30個(gè)循環(huán): 95 ℃變性45 s, 53 ℃退火60 s, 72 ℃延伸60 s。反硝化菌功能基因和定量PCR, 選擇的反應(yīng)體系(50 μL)包括25 μL的SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa, 日本), 1 μL的DNA模板和上下游引物各1 μL(10 μmol?L-1), 剩余的用無(wú)菌水補(bǔ)齊至50 μL。的擴(kuò)增引物選用[26], PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min; 35個(gè)循環(huán): 95 ℃變性30 s, 58 ℃退火45 s, 72 ℃延伸45 s。的擴(kuò)增引物選用[27], PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min; 35個(gè)循環(huán): 94 ℃變性45 s, 55 ℃退火45 s, 72 ℃延伸1 min。質(zhì)粒和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作按照王曉輝[28]的方法。

1.8 數(shù)據(jù)采集與分析

數(shù)據(jù)用SPSS 19分析軟件進(jìn)行單因素方差分析和相關(guān)性分析。文中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。用Microsoft Excel 2007制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 土層交換對(duì)玉米土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

從表1看出, 非根際土壤中, SE處理和CK處理之間, 土壤pH和可溶性有機(jī)氮含量無(wú)顯著差異。但與CK處理相比, SE處理的可溶性有機(jī)碳含量和NH4+-N含量顯著增加, NO3--N含量則顯著降低。在根際土壤中, SE處理和CK處理的土壤基礎(chǔ)化學(xué)性狀各指標(biāo)無(wú)顯著差異。根際土壤NO3--N含量低于非根際, 這可能和作物根際的氮素吸收有關(guān)。

表1 土層交換對(duì)0~20 cm土層土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

CK: 常規(guī)土層處理; SE: 土層交換處理。不同小寫(xiě)字母表示非根際或根際土土層交換與對(duì)照處理間具有顯著性差異(<0.05)。CK: normal soil layers distribution; SE: soil layers exchange. Different lowercase letters represent significant difference between CK and SE treatments of bulk soil or rhizopsheric soil (< 0.05).

2.2 土層交換對(duì)土壤呼吸的影響

由圖2A可知, SE處理0~20 cm土層非根際的土壤呼吸顯著高于CK處理, 主要由于0~10 cm土層SE處理較CK處理顯著增加。與非根際土壤相比, 根系刺激了土壤呼吸, 使0~10 cm CK和SE處理、10~20 cm CK和SE處理的根際土壤呼吸分別增加55.7%和23.5%、36.9%和48.6%, 根系對(duì)CK處理的刺激效果較強(qiáng)(圖2A, 2B)。但0~20 cm土層根際CK和SE處理的土壤呼吸無(wú)顯著差異(圖2B)。

圖2 土層交換對(duì)非根際(A)和根際(B)土壤呼吸速率的影響

CK: 常規(guī)土層處理; SE: 土層交換處理。不同小寫(xiě)字母表示土層交換與對(duì)照處理間差異顯著(<0.05)。CK: normal soil layersdistribution; SE: soil layers exchange. Different lowercase letters represent significant difference between CK and SE treatments (< 0.05).

2.3 土層交換對(duì)土壤硝化勢(shì)和氨氧化細(xì)菌及古菌的影響

由圖3可知, 0~20 cm土層非根際SE處理和CK處理的硝化潛勢(shì)無(wú)顯著差異, 而根際SE處理的硝化潛勢(shì)顯著低于CK處理。在根際和非根際, 0~10 cm土層SE處理的土壤硝化潛勢(shì)較CK處理顯著降低, 而10~20 cm土層SE處理的土壤硝化潛勢(shì)較CK處理顯著升高(圖3A, 3B)。

圖3 土層交換對(duì)非根際(A)和根際(B)土壤硝化潛勢(shì)的影響

CK: 常規(guī)土層處理; SE: 土層交換處理。不同小寫(xiě)字母表示土層交換與對(duì)照處理間差異顯著(<0.05)。CK: normal soil layersdistribution; SE: soil layers exchange. Different lowercase letters represent significant difference between CK and SE treatments (< 0.05).

如圖4和圖5所示, AOB-基因拷貝數(shù)是AOA-的64.4~231.4倍, 可見(jiàn)砂姜黑土的AOB占優(yōu)勢(shì)地位。在非根際和根際, 0~20 cm土層SE處理的AOB-基因拷貝數(shù)較CK處理顯著降低, 主要由于0~10 cm土層SE處理的AOB-基因拷貝數(shù)較CK處理顯著降低(圖4A, 圖4B)。

圖4 土層交換對(duì)非根際(A)和根際(B)氨氧化細(xì)菌豐度的影響

CK: 常規(guī)土層處理; SE: 土層交換處理。不同小寫(xiě)字母表示土層交換與對(duì)照處理間差異顯著(<0.05)。CK: normal soil layersdistribution; SE: soil layers exchange. Different lowercase letters represent significant difference between CK and SE treatments (< 0.05).

由圖5可知, 0~20 cm土層非根際SE處理的AOA-基因拷貝數(shù)較CK處理顯著降低, 是因?yàn)?~10 cm和10~20 cm土層SE處理的AOA-基因拷貝數(shù)較CK處理均顯著降低(圖5A); 而根際SE處理的AOA-基因拷貝數(shù)較CK處理顯著升高(圖5B)。相比非根際, 根系使0~10 cm、10~20 cm土層CK和SE處理的根際AOA-基因拷貝數(shù)分別變化–27.0%和84.0%、–26.4%和47.9%?？梢?jiàn)根際SE處理的AOA-基因拷貝數(shù)較CK處理顯著升高, 是因?yàn)楦凳笴K處理的AOA-基因拷貝數(shù)顯著降低、SE處理的AOA-基因拷貝數(shù)顯著升高(圖5A, 圖5B)。

2.4 土層交換對(duì)土壤反硝化作用和反硝化菌群豐度的影響

由圖6可知, 0~20 cm土層非根際SE處理的土壤反硝化能力顯著高于CK處理, 是因?yàn)?~10 cm和10~20 cm土層SE處理的土壤反硝化能力較CK處理都顯著升高(圖6A); 而根際SE處理的土壤反硝化能力較CK處理也顯著升高(圖6B), 是由于10~20 cm土層SE處理土壤反硝化能力顯著高于對(duì)照。對(duì)比非根際, 根系刺激了土壤反硝化能力, 使0~10 cm、10~20 cm土層CK和SE處理根際的反硝化能力分別增加75.8%和6.9%、37.5%和49.9%, 可見(jiàn)根系對(duì)CK處理的反硝化能力刺激效果較強(qiáng)(圖6A, 圖6B)。

由圖7可知, 根際和非根際, 0~20 cm土層的反硝化潛勢(shì)大小為: SE處理

圖5 土層交換對(duì)非根際(A)和根際(B)氨氧化古菌豐度的影響

CK: 常規(guī)土層處理; SE: 土層交換處理。不同小寫(xiě)字母表示土層交換與對(duì)照處理間差異顯著(<0.05)。CK: normal soil layers distribution; SE: soil layers exchange. Different lowercase letters represent significant difference between CK and SE treatments (< 0.05).

圖6 土層交換對(duì)非根際(A)和根際(B)土壤反硝化能力的影響

CK: 常規(guī)土層處理; SE: 土層交換處理。不同小寫(xiě)字母表示土層交換與對(duì)照處理間差異顯著(<0.05)。CK: normal soil layers distribution; SE: soil layers exchange. Different lowercase letters represent significant difference between CK and SE treatments (< 0.05).

圖7 土層交換對(duì)非根際(A)和根際(B)土壤反硝化潛勢(shì)的影響

CK: 常規(guī)土層處理; SE: 土層交換處理。不同小寫(xiě)字母表示土層交換與對(duì)照處理間差異顯著(<0.05)。CK: normal soil layers distribution; SE: soil layers exchange. Different lowercase letters represent significant difference between CK and SE treatments (< 0.05).

由圖8可知, 0~20 cm土層非根際SE處理的拷貝數(shù)較CK處理顯著降低, 主要是因?yàn)?0~20 cm土層SE處理的拷貝數(shù)較CK處理顯著降低; 而根際SE處理的拷貝數(shù)較CK處理也顯著降低。對(duì)比非根際, 根系使0~10 cm、10~20 cm土層CK和SE處理的根際拷貝數(shù)分別變化42.5%和–28.8%、–45.6%和20.5%(圖8A, 圖8B)。

圖8 土層交換對(duì)非根際(A)和根際(B)土壤nirK拷貝數(shù)的影響

CK: 常規(guī)土層處理; SE: 土層交換處理。不同小寫(xiě)字母表示土層交換與對(duì)照處理間差異顯著(<0.05)。CK: normal soil layers distribution; SE: soil layers exchange. Different lowercase letters represent significant difference between CK and SE treatments (< 0.05).

由圖9可知, 0~20 cm土層非根際SE處理的拷貝數(shù)顯著低于CK處理, 而根際SE處理的拷貝數(shù)和CK處理無(wú)顯著差異。對(duì)比非根際, 根系使0~10 cm、10~20 cm土層CK和SE處理的根際拷貝數(shù)分別變化321.5%和56.4%、–33.6%和5.8%(圖9A, 圖9B)。

圖9 土層交換對(duì)非根際(A)和根際(B)土壤nirS拷貝數(shù)的影響

CK: 常規(guī)土層處理; SE: 土層交換處理。不同小寫(xiě)字母表示土層交換與對(duì)照處理間差異顯著(<0.05)。CK: normal soil layers distribution; SE: soil layers exchange. Different lowercase letters represent significant difference between CK and SE treatments (< 0.05).

2.5 土層交換對(duì)玉米根系和植株形態(tài)生理指標(biāo)的影響

從表2可知, 與CK處理相比, SE處理顯著增加根平均直徑和根尖數(shù)。但兩處理在根表面積和根系全氮含量等其他根系指標(biāo)上均無(wú)顯著差異。

由表3可知, 與CK處理相比, SE處理使玉米植株的SPDA值和根冠比顯著降低, 植株全氮含量也降低8.9%(<0.05)。SE處理對(duì)植株干重?zé)o差異影響, 但顯著提高了莖稈干重(<0.05)。

2.6 土層交換后土壤硝化、反硝化過(guò)程中測(cè)定變量之間的相關(guān)性

由表4可知, 非根際土硝化潛勢(shì)與NO3--N和土壤可溶性有機(jī)氮呈極顯著正相關(guān)(<0.01), 同時(shí)三者也與AOB-拷貝數(shù)呈極顯著正相關(guān)(<0.01), 而AOA-拷貝數(shù)與硝化潛勢(shì)的相關(guān)性不顯著。反硝化能力與土壤可溶性有機(jī)碳和土壤呼吸呈極顯著正相關(guān)(<0.01), 與和拷貝數(shù)的相關(guān)性未達(dá)到顯著水平。但反硝化潛勢(shì)與拷貝數(shù)呈極顯著正相關(guān)(<0.01), 與拷貝數(shù)也達(dá)到顯著相關(guān)水平(<0.05)。

表2 土層交換對(duì)玉米根系形態(tài)生理指標(biāo)的影響

CK: 常規(guī)土層處理; SE: 土層交換處理。不同小寫(xiě)字母表示非根際或根際土土層交換與對(duì)照處理間具有顯著性差異(<0.05)。CK: normal soil layers distribution; SE: soil layers exchange. Different lowercase letters represent significant difference between CK and SE treatments (< 0.05).

表3 土層交換對(duì)玉米植株形態(tài)生理指標(biāo)的影響

CK: 常規(guī)土層處理; SE: 土層交換處理。不同小寫(xiě)字母表示非根際或根際土土層交換與對(duì)照處理間具有顯著性差異(<0.05)。CK: normal soil layers distribution; SE: soil layers exchange. Different lowercase letters represent significant difference between CK and SE treatments (< 0.05).

表4 土層交換后非根際土壤硝化、反硝化過(guò)程中測(cè)定變量之間的相關(guān)性

DOC: 可溶性有機(jī)碳; DON: 可溶性有機(jī)氮; SR: 土壤呼吸速率; NP: 硝化潛勢(shì); DC: 反硝化能力; DP: 反硝化潛勢(shì); AOB-: AOB拷貝數(shù); AOA-: AOA拷貝數(shù)::拷貝數(shù);:拷貝數(shù)。*:< 0.05; **:< 0.01. DOC: dissolved organic carbon; DON: dissolved organic nitrogen; SR: soil respiration; NP: nitrification potential; DC: denitrification capacity; DP: denitrification potential; AOB-: copies of AOB-gene; AOA-: copies of AOA-gene;: copies ofgene;: copies ofgene.

2.7 土層交換后玉米氮素吸收與土壤硝化、反硝化過(guò)程和植株及根系形態(tài)生理指標(biāo)變量之間的相關(guān)性

由表5可知, 根系全氮與根平均直徑和根表面積呈極顯著正相關(guān)(<0.01), 而植株全氮與根平均直徑和根表面積則無(wú)顯著相關(guān)性。根尖數(shù)與植株全氮呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05)。根際土硝化潛勢(shì)與植株全氮呈顯著正相關(guān)(<0.05), 與根系全氮呈極顯著正相關(guān)(<0.01)。根表面積×AOB拷貝數(shù)與根系全氮和植株全氮呈顯著正相關(guān)(<0.05)。非根際土壤的反硝化能力與植株全氮呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05), 根際土壤的反硝化能力與植株全氮呈極顯著負(fù)相關(guān)(<0.01)。

3 討論

土層交換通過(guò)改變土壤的物理、化學(xué)和生物性狀, 影響作物的生長(zhǎng)和氮素的利用[29-31]。本研究發(fā)現(xiàn)土層交換后, 玉米的植株氮素吸收會(huì)顯著下降。土壤耕作可通過(guò)影響根系來(lái)控制個(gè)體和群體的發(fā)育[32]。土層交換后, 玉米根系的根尖數(shù)和根平均直徑都顯著增加。前人研究發(fā)現(xiàn), 翻耕較免耕處理能顯著增加玉米的根尖數(shù), 但對(duì)根平均直徑無(wú)顯著影響[33-34]。本研究中, 根平均直徑顯著增加可能與兩個(gè)處理下NH4+-N和NO3--N的含量和比例有關(guān)。一般來(lái)說(shuō)NH4+-N會(huì)促進(jìn)玉米中柱的發(fā)育, 有利于木質(zhì)部形成, 進(jìn)而促進(jìn)根直徑的增加[35]。本研究發(fā)現(xiàn)交換土層會(huì)顯著降低根際的硝化潛勢(shì), 這將會(huì)相對(duì)增加NH4+-N的含量, 進(jìn)而增加了根系的直徑。玉米葉片SPAD值表征了葉片氮素含量[36]。土層交換后, 玉米葉片SPDA值顯著降低, 可能是由土壤供氮能力顯著降低導(dǎo)致的; 葉片光合性能的下降可能會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致玉米吸氮效率的降低。但相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn), 它們與玉米植株氮素吸收相關(guān)性不顯著。由此可見(jiàn), 盡管土層交換會(huì)顯著影響根系的根尖數(shù)、根平均直徑和葉片SPAD, 但這些改變可能不是造成植株氮素吸收差異的主要原因。

表5 土層交換后玉米氮素吸收與土壤硝化、反硝化過(guò)程和植株及根系形態(tài)生理指標(biāo)之間的相關(guān)性

NP: 硝化潛勢(shì); DC: 反硝化能力; DP: 反硝化潛勢(shì)。*:< 0.05; **:< 0.01. NP: nitrification potential; DC: denitrification capacity; DP: denitrification potential.

比較土層交換后硝化潛勢(shì)的改變發(fā)現(xiàn), 盡管土層交換不會(huì)顯著降低非根際土壤的硝化潛勢(shì), 但會(huì)顯著降低根際土壤的硝化潛勢(shì)。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)根際的硝化潛勢(shì)與玉米的植株氮素吸收呈顯著性正相關(guān)?？梢?jiàn), 土層交換會(huì)顯著降低根際土壤硝化潛勢(shì), 進(jìn)而降低作物的氮素利用效率。一般來(lái)說(shuō)硝化作用降低會(huì)減少NO3-產(chǎn)生速率, 而NO3-作為陰離子, 遷移性較強(qiáng), 容易造成淋洗和反硝化損失[37]。因此土層交換后硝化潛勢(shì)降低, 應(yīng)該有利于作物對(duì)氮素的吸收。但本研究中土壤的pH達(dá)到8.5, 將會(huì)增加氨的揮發(fā)損失[38]。這可能是硝化潛勢(shì)下降, 而作物的氮素吸收顯著降低的重要原因。AOB和AOA是硝化過(guò)程的主要執(zhí)行者[25,39]。AOA是新的氨氧化微生物類(lèi)群, 其廣泛分布于各種生態(tài)系統(tǒng)中, 并且在諸多環(huán)境中其數(shù)量較AOB占明顯優(yōu)勢(shì), 在農(nóng)田土壤中可能發(fā)揮著重要功能[40-42]。本研究發(fā)現(xiàn)土層交換后, AOA和AOB的種群豐度都會(huì)顯著下降, 但在根際土壤中, AOB豐度顯著下降, AOA反而上升。進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn), 硝化潛勢(shì)與AOB豐度呈顯著正相關(guān)關(guān)系, 而與AOA沒(méi)有顯著相關(guān)關(guān)系。由此可以看出, AOB在根際土壤中發(fā)揮著重要功能。本研究進(jìn)一步推測(cè), 在根際環(huán)境中, AOB可能扮演著更為重要的角色。目前很多研究中, 常把根際土壤中的氮轉(zhuǎn)化相關(guān)基因拷貝數(shù)直接與作物氮素吸收進(jìn)行相關(guān)分析[43-44], 但是沒(méi)有考慮作物的根表面積。因?yàn)楦砻娣e和基因拷貝數(shù)相結(jié)合, 才更能代表真實(shí)的情況[45-46]。本研究發(fā)現(xiàn), 根表面積和AOB拷貝數(shù)的乘積與作物的氮素吸收量呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系, 可見(jiàn)AOB是影響作物氮素吸收的關(guān)鍵微生物。

除了硝化潛勢(shì)發(fā)生改變外, 本研究注意到, 土層交換也會(huì)顯著增加非根際和根際土壤的反硝化能力。反硝化是氮素?fù)p失的重要途徑, 反硝化速率的提升, 意味著氮素氣態(tài)損失加重。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn), 根際的反硝化能力與玉米的植株氮素吸收呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。土層交換引起反硝化損失的加重, 可能受到土壤理化性狀和反硝化微生物的影響。本研究發(fā)現(xiàn), 與其他土壤環(huán)境因素相比, 土層交換會(huì)顯著增加可溶性有機(jī)碳含量。可溶性有機(jī)碳是異養(yǎng)反硝化微生物的重要能量來(lái)源, 因此可溶性有機(jī)碳含量的富集會(huì)顯著增加反硝化能力[47], 同時(shí)也增加了土壤呼吸速率。土壤呼吸速率的增加, 會(huì)升高土壤CO2濃度, 并進(jìn)一步增進(jìn)土壤厭氧環(huán)境, 促進(jìn)反硝化的進(jìn)行。當(dāng)碳源充足條件下, 本研究發(fā)現(xiàn)土層交換后反而會(huì)導(dǎo)致反硝化潛勢(shì)下降。由此可見(jiàn)可溶性有機(jī)碳是土層交換后反硝化速率的關(guān)鍵限制因子。除了受到可溶性有機(jī)碳和CO2濃度的影響外, 我們分析了和種群豐度的變化。研究發(fā)現(xiàn)土層交換后, 非根際土壤中和拷貝數(shù)都呈下降趨勢(shì), 而根際土壤中拷貝數(shù)保持顯著下降趨勢(shì),卻沒(méi)有顯著下降。相關(guān)分析表明,和拷貝數(shù)與反硝化潛勢(shì)呈顯著正相關(guān)的關(guān)系, 而與反硝化能力相關(guān)性不顯著。這也進(jìn)一步證實(shí), 土層交換后可溶性有機(jī)碳而非或菌群豐度, 是反硝化能力的關(guān)鍵主導(dǎo)因子。

4 結(jié)論

土層交換使玉米的氮素吸收率顯著降低8.9%, 植株的葉片SPDA值和根冠比也都顯著降低。土層交換后, 硝化速率的降低和反硝化速率的增強(qiáng)是玉米氮素利用效率降低的重要原因。AOB是硝化速率的主要驅(qū)動(dòng)微生物, 在根際的氮素轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要功能。土層交換導(dǎo)致的可溶性有機(jī)碳和土壤呼吸的增加, 可能是導(dǎo)致反硝化速率顯著增高的主要原因。

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Effects of soil layers exchange on key nitrogen transformation processes in soil and nitrogen utilization by maize*

YANG Shuo1, JIN Wenjun1, HUANG Haimeng1, WANG Jun1, ZHOU Debao2, ZHAO Yangyang1, DONG Zhaorong1, SONG He1**

(1. College of Agronomy, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2. Suzhou Academy of Agricultural Sciences, Suzhou 234000, China)

Soil layers are exchanged during tillage practices, which may change the nitrogen (N) transformation process by affecting the physicochemical and biochemical properties of the soil. In this study, the effects of soil layers exchange on the nitrification and denitrification of lime concretion black soil, maize growth, and N utilization were studied to provide a theoretical basis for selecting reasonable tillage methods, reducing N loss, and improving N use efficiency in the southern region of the Huang-Huai-Hai Plain.In an artificial climate chamber, a normal soil layer distribution (0-35 cm of soil placed in a root box according tosoil layers) was used as the control treatment (CK).0-10 cm and 10-20 cm soil layers were exchanged and placed in another group of root boxes, which were used as the soil layers exchange (SE) treatment group. A 20 μm nylon mesh was used to separate the rhizosphere and the bulk soil. To investigate the effects of soil layer exchange on soil N transformation, nitrification potential, respiration, denitrifying capacity, denitrification potential, physicochemical properties of the rhizosphere and bulk soil, as well as maize growth, and N use, total N content, and root morphology were investigated at the maize small trumpet stage. The results showed thatmaize N uptake in SE treatment was 8.9% lower than that of CK (0.05). Soil layer exchange significantly affected the rhizosphere rather than the bulk soil, which reduced its nitrification potential by 13.5% (< 0.05) and increased the denitrification capacity of the rhizosphere and the bulk soil by 36.6% (< 0.05) and 8.4% (< 0.05), respectively. Soil layers exchange increased the soluble organic carbon content of the rhizosphere and bulk soil by 11.7% (0.05) and 5.2%, respectively. Correlation analysis showed that nitrification potential was significantly positively correlated with the abundance of ammonia-oxidizing bacteria (AOB,= 0.91**), but was not significantly correlated with the abundance of ammonia-oxidizing archaea (AOA). Denitrification capacity was significantly positively correlated with soluble organic carbon and soil respiration (= 0.89**and 0.93**), but showed no correlation withorgene copy number. N uptake by maize plants was positively correlated with the nitrification potential of the rhizosphere and the total root surface area × AOB gene copy number (= 0.83*and 0.86*), but was significantly negatively correlated with denitrification capacity (= –0.88**). These results indicated that a decrease in the nitrification rate and an increase in the denitrification rate in lime concretion black soil could result in low N use efficiency by maize after soil layers exchange. The nitrification rate was driven more by AOB abundance. After soil layers exchange, soil soluble organic carbon was the key driving factor for denitrification capacity. Effective regulation of soil soluble organic carbon content is the key to improving crop nitrogen use efficiency under tillage conditions.

Soil layer exchange; Maize; Rhizosphere; Nitrification; Denitrification; Nitrogen utilization

, E-mail: songhesonghe@foxmail.com

Apr. 8, 2019;

May 20, 2019

S158.3

2096-6237(2019)10-1515-13

N E, LóPEZ-GUTIéRREZ J C, et al. Quantification of denitrifying bacteria in soils by nirK gene targeted real-time PCR[J]. Journal of Microbiological Methods, 2004, 59(3): 327-335

宋賀, 主要研究方向?yàn)榈吞嫁r(nóng)業(yè)生產(chǎn)。E-mail: songhesonghe@foxmail.com

楊碩, 主要研究方向?yàn)榈吞嫁r(nóng)業(yè)生產(chǎn)。E-mail: 1750372904@qq.com

2019-04-08

2019-05-20

* This study was funded by the National Key Research and Development Project of China (2017YFD0301307-05, 2016YFD0300205-03) and the Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest of China (201503121-02).

* 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2017YFD0301307-05, 2016YFD0300205-03)和公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201503121-02)資助

10.13930/j.cnki.cjea.190265

楊碩, 金文俊, 黃海蒙, 王軍, 周得寶, 趙陽(yáng)陽(yáng), 董召榮, 宋賀. 耕層土層交換對(duì)土壤氮素關(guān)鍵轉(zhuǎn)化過(guò)程和玉米氮素利用的影響[J]. 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)(中英文), 2019, 27(10): 1515-1527

YANG S, JIN W J, HUANG H M, WANG J, ZHOU D B, ZHAO Y Y, DONG Z R, SONG H. Effects of soil layers exchange on key nitrogen transformation processes in soil and nitrogen utilization by maize[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2019, 27(10): 1515-1527