藏藥三味寬筋藤湯散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000；2.阿壩州藏醫(yī)醫(yī)院，四川 馬爾康 513229

三味寬筋藤湯散，藏文音譯是“勒哲松湯”，原方載于《四部醫(yī)典》，由寬筋藤、渣馴膏、訶子肉三味藏藥組成[1]，劑型為湯散劑，具有祛風(fēng)除痹、消腫止痛、干黃水的作用。用于關(guān)節(jié)急慢性紅腫、脹痛、伸屈不利、四肢僵硬，痛風(fēng)、痹證。作為經(jīng)典藏藥處方，在阿壩州藏醫(yī)醫(yī)院臨床上主要應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)等，效果佳，但通過(guò)查詢尚無(wú)其質(zhì)量控制的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。訶子為 《中國(guó)藥典》收載的傳統(tǒng)藥物品種，尤其在民族醫(yī)學(xué)藏藥和蒙藥中最為常用[2]，為本處方的主要藥味之一，其有效成分沒(méi)食子酸的含量較高。沒(méi)食子酸具有解痙、抗氧化、抗菌及強(qiáng)心等藥理作用[3]，與三味寬筋藤湯散的臨床藥效密切相關(guān)。本文初步建立藏藥三味寬筋藤湯散的質(zhì)控項(xiàng)目，采用顯微鑒別法、薄層色譜法、理化鑒別法定性鑒別藏藥三味寬筋藤湯散中的寬筋藤、訶子2味藥材，高效液相色譜法測(cè)定沒(méi)食子酸相對(duì)含量，這對(duì)建立藏藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有著重要意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津)；BX35生物顯微鏡II (奧林巴斯醫(yī)療株式會(huì)社)；JPCT0328全數(shù)字超聲波發(fā)生器(武漢嘉鵬電子有限公司)；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；AUW120D電子天平(SHIMADZU)；JA203H型電子天平(常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司)；HH-S8數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金怡儀器科技有限公司)。

1.2 材料 沒(méi)食子酸對(duì)照品(批號(hào)：110831-201605，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；訶子對(duì)照藥材(批號(hào)：121015-201605，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；寬筋藤、訶子肉、渣馴藥材，經(jīng)阿壩州藏醫(yī)醫(yī)院澤戈主任藏醫(yī)藥師鑒定為正品，均由阿壩州藏醫(yī)醫(yī)院制劑中心提供；三味寬筋藤湯散(批號(hào)：20190211，阿壩州藏醫(yī)醫(yī)院配制)；甲醇為色譜純，水為哇哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別 寬筋藤為莖類藥材，渣馴膏為巖石中富含腐殖質(zhì)的古生物化石在地質(zhì)作用下滲出后，與復(fù)齒鼯鼠或紅耳鼠兔糞粒的混合物[4]，訶子肉為果實(shí)類藥材，三者顯微特征差別較大，具有互不干擾的專屬性特征，并易于觀察。將三味寬筋藤湯散制片后(染色片、水合氯醛透化片、水裝片等)，置于顯微鏡下觀察。

2.1.1 寬筋藤 將三味寬筋藤湯散制片后在顯微鏡下觀察，可見(jiàn)韌皮纖維成束，周?chē)”诩?xì)胞含方晶成晶鞘纖維，為寬筋藤的顯微特征[5]。

2.1.2 訶子肉 將三味寬筋藤湯散制片后在顯微鏡下觀察，可見(jiàn)多數(shù)石細(xì)胞，呈類方形、類多角型或不規(guī)則形，有的一端稍膨大，細(xì)胞壁上紋孔密集，為訶子的顯微特征[6]。

2.2 理化鑒別[7]寬筋藤中主要成分為生物堿[8]，參考藥品標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)其生物堿進(jìn)行理化鑒別。取寬筋藤藥材、三味寬筋藤湯散、三味寬筋藤湯散(缺寬筋藤)三種粉末各5 g，分別加入酸性乙醇30 mL，回流30 min，濾過(guò)，取濾液15 mL，用5%氫氧化鈉溶液調(diào)至中性，水浴上蒸干，加入6 mL5%硫酸溶液溶解，濾過(guò)，取濾液3 mL分置A、B、C三支小試管中，每支試管1 mL，依次加入碘化鉍鉀試液、碘化汞鉀試液、硅鎢酸試液1～2滴，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 理化鑒別結(jié)果

2.3 薄層鑒別 參考文獻(xiàn)[9]和2015 年版《中國(guó)藥典》四部通則0502 薄層色譜法[10]，精密稱取三味寬筋藤湯散2 g，訶子對(duì)照藥材0.5 g，三味寬筋藤湯散(缺訶子肉)2 g，分別加入5 mL乙醇溶液，超聲處理(功率250W，頻率40kHZ)0.5 h，放冷，取上清液濾過(guò)，取續(xù)濾液，待用。吸取上述三種溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(6∶10∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。三味寬筋藤湯散與訶子對(duì)照藥材在色譜相應(yīng)的位置，顯相同顏色的斑點(diǎn)，三味寬筋藤湯散(缺訶子肉)無(wú)干擾。如圖1所示。

2.4 HPLC法測(cè)定沒(méi)食子酸的含量

2.4.1 色譜條件[11-12]色譜柱：Inertsil ODS-SP C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：40℃；流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸溶液(2∶98)；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)273 nm；進(jìn)樣量10 μL，理論塔板數(shù)按沒(méi)食子酸計(jì)算應(yīng)不低于2000。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品10.65 mg，置25 mL棕色量瓶中，加入50 %甲醇溶解并定容，即得0.426 mg/mL溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 精密稱取三味寬筋藤湯散(20190211)0.4 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減少的重量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.4.4 陰性樣品溶液 按處方(除訶子肉藥材外)與制法，制成陰性樣品溶液。其余處理同供試品溶液。

2.4.5 測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液10 μL與供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，即得。如圖2所示。

2.4.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.4.2”項(xiàng)下沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mL，分別置于10 mL棕色容量瓶中，50%甲醇定容，搖勻，得到對(duì)照品溶液濃度分別為：0.004 26、0.021 3、0.042 6、0.106 5、0.213、0.426 mg/mL溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL測(cè)定峰面積，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)，對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行回歸，得回歸方程為y=29193x+ 141618(R2=0.9993)，在0.004 26～0.426 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.4.2”項(xiàng)下沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液0.5 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，50%甲醇定容，搖勻，精密吸取10 μL，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得其平均峰面積值為717643，RSD為1.88%。表明儀器精密度良好。

2.4.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.4.3”項(xiàng)下供試品溶液10 μL，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)得峰面積RSD為1.42%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)(20190211)樣品6份，按2.4.3方法制備，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果沒(méi)食子酸平均相對(duì)含量為5.37 mg/g，RSD為0.88%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.4.10 加樣回收率試驗(yàn) 取三味寬筋藤湯散(20190211)6份，每份約0.2 g，精密稱定，1、2號(hào)樣品加入含有量50%沒(méi)食子酸對(duì)照品，3、4 號(hào)樣品加入含有量 100%沒(méi)食子酸對(duì)照品，5、6 號(hào)樣品加入含有量 150%沒(méi)食子酸對(duì)照品，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，各取10 μL進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 沒(méi)食子酸加樣回收率結(jié)果 (n=6)

2.4.11 耐用性 取三味寬筋藤湯散(20190211)，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備，分別在色譜條件小的變動(dòng)條件下：柱溫(40.0±5)℃，流速(1.0±0.2)mL/min，波長(zhǎng)(273±2)nm，測(cè)定沒(méi)食子酸相對(duì)含量的RSD為1.62%，結(jié)果表明，此高效液相色譜條件測(cè)定沒(méi)食子酸對(duì)照品時(shí)，柱溫、流速、波長(zhǎng)的變動(dòng)小時(shí)耐用性強(qiáng)，滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求，本方法準(zhǔn)確可靠。

3 討論

3.1 理化鑒別 寬筋藤藥材標(biāo)準(zhǔn)鑒別項(xiàng)下中有加新配重氮化試劑，顯紅色，由于三味寬筋藤湯散含渣馴膏，其在提取過(guò)程中溶液顯酒紅色，這個(gè)顏色反應(yīng)不明顯，故選擇碘化鉍鉀試液、碘化汞鉀試液、硅鎢酸試液作為三味寬筋藤湯散的理化鑒別的顯色試劑，沉淀明顯。

3.2 薄層鑒別 預(yù)實(shí)驗(yàn)按照《中國(guó)藥典》2015年版訶子項(xiàng)下對(duì)訶子藥材進(jìn)行定性分析，樣品處理方法過(guò)于復(fù)雜，且重復(fù)性較差；樣品處理方法直接選擇超聲處理(功率250W，頻率40kHZ)0.5 h，放冷，取上清液濾過(guò)，取續(xù)濾液，待用；展開(kāi)劑調(diào)整為甲苯-乙酸乙酯-甲酸(6∶10∶1)，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃下加熱顯色，日光下檢視，對(duì)照藥材主斑點(diǎn)顯色明顯，供試樣品相應(yīng)位置斑點(diǎn)分離較好且陰性供試品無(wú)干擾。

3.3 色譜條件的選擇 根據(jù)參考文獻(xiàn)[11-12]，選擇流動(dòng)相：乙腈-0.05%甲酸水溶液和甲醇-0.2%磷酸溶液，結(jié)果表明甲醇-0.2%磷酸對(duì)三味寬筋藤中沒(méi)食子酸的分離效果較好。經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終確定流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸(2∶98)，既能確保柱效的穩(wěn)定性，又可達(dá)到較好的分離效果。