微分離技術研究寒地丁香胚珠的發(fā)育機制

張馨默，劉麗萍*

（1.黑龍江大學/農(nóng)業(yè)微生物技術教育部工程研究中心；2.黑龍江大學生命科學學院/黑龍江省普通高校分子生物學重點實驗室，黑龍江哈爾濱150000）

丁香的雌配子體（megagametophyte）是丁香胚珠的主要核心結(jié)構(gòu)，利用微分離技術制片觀察丁香雌配子體減數(shù)分裂行為的發(fā)生機制。減數(shù)分裂是丁香胚珠發(fā)育過程中的關鍵時期。丁香雌配子體的成熟和卵細胞的正常發(fā)生，可對寒地丁香的生長生殖和發(fā)育起主導作用。因此，對寒地丁香大孢子母細胞時期的胚珠發(fā)育機制進行研究，具有重要的理論和實踐意義。

目前，調(diào)控胚珠發(fā)育的分子機制已見報道，但利用微分離技術對丁香大孢子母細胞的發(fā)育機制進行的相關研究尚未見報道。課題組在微分離丁香胚珠的過程中發(fā)現(xiàn)丁香的胚囊有分隔，并一分為四，隔為十字交叉，每個隔內(nèi)都有1個胚珠，認為這一現(xiàn)象是多種基因共同調(diào)控表達的結(jié)果。是丁香的功能基因綜合表達的產(chǎn)物，直接體現(xiàn)丁香生長發(fā)育的調(diào)控特點。因此，本文采用形態(tài)學、解剖學和細胞學等研究手段，對寒地丁香雌配子體有絲分裂期的胚珠進行制片研究，以揭示寒地丁香雌配子體有絲分裂調(diào)控機制。

研究結(jié)果：對寒地丁香的大孢子母細胞發(fā)生發(fā)育過程中的形態(tài)學和解剖學特征進行了系統(tǒng)觀察，準確掌握了丁香胚珠發(fā)育的數(shù)量，得到主要結(jié)果如下，當寒地丁香花絮約為8.0 mm時，腋芽原基發(fā)育，入冬后花芽休眠。至第2年春季4～5月，花絮約為6.0 mm時，胚珠細胞分化。在胚囊約為5.0 mm時，大孢子母細胞分化；約為11.0 mm時，胚珠體細胞中當雌配子體開始形成細胞壁時，頸卵器原始細胞分化；約為43.0 mm時，頸卵器、卵細胞發(fā)育成熟，雌配子體細胞化完成；約為45.0 mm時，受精作用發(fā)生。胚囊內(nèi)即可觀察到成熟胚。在丁香大孢子母細胞的發(fā)生發(fā)育過程中對處于雌配子體旺盛分裂期的丁香胚珠進行了微分離技術的分離分析。最終在上百個胚囊中分離胚珠大約400個。有30個胚珠中處于雌配子體分裂前、后期的丁香胚珠。它們在有絲分裂期，胚珠內(nèi)的物質(zhì)供給短缺和能量代謝異常共同導致了蛋白質(zhì)合成和DNA復制發(fā)生異常。在胚珠遭受氧化脅迫時，與細胞信號轉(zhuǎn)導相關的蛋胚珠細胞最終開啟了細胞程序化死亡進程，導致雌配子體游離核有絲分裂失敗。

我國對丁香的研究主要集中在新品種培育和栽培管理等方面，而對丁香胚珠解剖及微分離方面的研究幾乎是空白。本次實驗將結(jié)合觀測丁香花、葉的組成結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)、微分離制片觀察技術明確丁香花的胚珠數(shù)、各部位結(jié)構(gòu)，以便研究丁香的生殖發(fā)育特性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本次實驗的材料為丁香，主要對丁香的胚珠進行微分離以及花粉的形態(tài)進行觀測和解剖研究。

1.2 方法

1.2.1 花的解剖方法 利用人工方法對丁香花的外部形態(tài)（花瓣、花萼、花托、花柱等）進行解剖測量和觀察，通過多組實驗求平均值（見表1）。

表1 丁香花卉的測量（平均值）（單位：cm）

1.2.2 花粉制片方法 取樣，解剖鏡分離丁香的花藥進行制片，經(jīng)改良品紅染色，普通光學顯微鏡觀察。丁香花粉呈單粒存在，為橢圓形細胞，被染成淡紫色，拍照保存。

1.2.3 葉片徒手切片方法徒手切片是將新鮮的或固定的實驗材料制成薄片的方法。切片時需要用左手固定好丁香的葉片，一般葉片需要伸出食指2～3mm，避免切到手指。右手在切片的時候需要與實驗材料保持垂直。注意用力的時候應使用臂力而不是手腕的力氣，時刻保持切面的濕潤，必要時需要向切面上滴加清水。徒手切片法具有簡便、迅速、易操作的優(yōu)點，并且容易觀察到植物組織的天然色澤與結(jié)構(gòu)。有利于研究植物解剖結(jié)構(gòu)，同時，它具有利于臨時觀察、能更快得到實驗結(jié)果[1]。

1.2.4 葉片染色方法 用番紅染液染色，將切片放入1%番紅染液染色10min，后用無水乙醇洗去浮色；再用0.1%固綠染液染近20s，用無水乙醇洗去浮色，封片觀察。用蘇木精染色，將材料放入1%蘇木精染液染色5min，后用無水乙醇洗去浮色；再用0.1%固綠染液染色近20s，用無水乙醇洗去浮色，封片觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征

丁香的花為傘狀花序，每個花序有小花7朵，花頂端呈傘形排列，花呈漏斗狀，花瓣有寬瓣，亦有細瓣，喇叭狀，使丁香看起來花團錦簇。丁香的花色以淡紫色為主，并且每朵花有4片花瓣、4個雄蕊、1個雌蕊。其花粉粒飽滿，呈圓形，單粒，傳粉簡單，花期4～5月。觀賞價值極高，受到大眾喜愛。

2.2 胚珠的形態(tài)特征

利用微分離技術分離丁香花的子房可得到胚珠，其子房下位，共4室，每室有1個胚珠。丁香胚珠的形態(tài)為直生型，即珠孔與珠柄在一條直線上。屬中軸胎座，厚珠心，胚囊發(fā)育的類型為蓼型。

2.3 胚珠發(fā)育機制實驗結(jié)果

2.3.1 胚珠的發(fā)育 受精前，胚珠由珠心、珠被、珠孔、珠柄組成，其中珠柄與胎座連接。在靠近珠心的位置逐漸生長出珠被，一般是內(nèi)珠被早于外珠被出現(xiàn)，最終珠被將珠心包圍只留下一孔，即珠孔。丁香的胚珠在發(fā)育的過程中，一般保持直生。

2.3.2 大孢子的發(fā)生大孢子的發(fā)生始于珠心表皮下分化的一個孢原細胞，這個細胞與其他細胞不同的是它的體積較大且細胞核明顯、胞質(zhì)濃厚。在厚珠心的胚珠中，孢原細胞一般進行平周分裂，產(chǎn)生一個周緣細胞和一個造孢細胞，其中造孢細胞將起大孢子母細胞的作用，進行減數(shù)分裂，最終形成4個單倍體數(shù)目的大孢子。通常除合點端的大孢子外，其余的3個大孢子逐漸退化[2]。

2.3.3 雌配子體的發(fā)育 丁香的胚囊也稱雌配子體，一般由7個細胞組成，即2個助細胞、1個卵子、1個帶有兩個極核的中央細胞、3個反足細胞。在胚囊的發(fā)育過程中，通常只有合點端的功能大孢子發(fā)育成胚囊，其依次經(jīng)歷細胞的體積變大、出現(xiàn)液泡、連續(xù)3次的核分裂，最終形成的8個核會處于共同的細胞質(zhì)中。因此，丁香的胚囊通常是由8個細胞核構(gòu)成7個細胞的蓼型結(jié)構(gòu)[3]。

3 結(jié)論

通過利用微分離技術對寒地丁香胚珠的發(fā)育機制的研究，確定丁香胚囊有分隔，每個隔有1個胚珠，一個胚囊共有4個胚珠。丁香為傘狀花序，花粉粒為圓形?；ǘ浞倍?，觀賞價值高[4]?；ǖ念伾珵榈仙偷凵ò甑幕撞繛槿榘咨?，花形狀為漏斗狀。丁香葉近心形，葉片上、下表皮細胞外壁均被有厚角質(zhì)層，氣孔器的保衛(wèi)細胞為腎形，具有發(fā)達的儲水組織；葉肉細胞同型，平行脈，維管束具有維管束鞘，上下表皮均有柵欄組織分布。光合作用輸送有機營養(yǎng)的能力強。這也驗證了葉的生物學特征：葉片革質(zhì)，質(zhì)地硬度大的特點。葉的薄壁細胞分布廣泛[5]。因此，可適當減少花的澆灌次數(shù)，便于種植。同時，也觀察到了螺紋導管等細胞結(jié)構(gòu)，疏導能力較強。表皮層角質(zhì)層較發(fā)達。葉綠體細胞較小，丁香的形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)能夠說明其具有耐陰、耐干旱等植物特性?；ǚ哿Ｐ螒B(tài)觀察結(jié)果為圓形，有待進行深入的研究觀察丁香花粉的減數(shù)分裂行為等。丁香的根系比較發(fā)達有分支，肉質(zhì)纖維狀，利于水分和無機鹽的輸送。本項研究為寒地丁香種質(zhì)資源的研究提供一定的參考依據(jù)。