脆性X綜合征外周血淋巴細胞永生化細胞系的建立與驗證

高飛，胡澤斌，孫楠，段然慧，游延軍，左甜甜，夏昆，黃杰

脆性X綜合征外周血淋巴細胞永生化細胞系的建立與驗證

高飛*，胡澤斌*，孫楠，段然慧，游延軍，左甜甜，夏昆，黃杰

100050 北京，中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑所非傳染病診斷試劑室（高飛、胡澤斌、孫楠、黃杰），中藥民族藥檢定所天然藥物室（左甜甜）；410078 長沙，中南大學生命科學學院醫(yī)學遺傳學研究中心（段然慧、夏昆）；611731 成都，四川省食品藥品檢驗檢測院（游延軍）

脆性 X 綜合征（fragile X syndrome，F(xiàn)XS）是一種 X 連鎖不完全外顯性遺傳病，是引起遺傳性智力低下和孤獨癥譜系障礙最常見的單基因病[1]，因細胞中 X 染色體末端在特殊培養(yǎng)基中經(jīng)誘變劑作用后可顯示如同斷裂的脆性部位而得名。男性患者多見且癥狀較重，表現(xiàn)為智力低下、巨睪、特殊面容、語言行為障礙等；女性攜帶者約 1/3 表現(xiàn)出智力低下或其他癥狀。95% ~ 99% 的 FXS 患者是由1基因 5'UTR CGG 重復擴增的動態(tài)突變和異常甲基化導致1 基因轉(zhuǎn)錄沉默、FMRP 蛋白合成減少或丟失所致。正常人群中 CGG 重復數(shù)目在 5 ~ 44 之間，最常見的重復數(shù)目為 29 或 30；CGG 重復數(shù)目在 45 ~ 54 之間時稱為灰區(qū)（中間型），該等位基因亦屬正常范圍；傳遞過程中可發(fā)生小尺寸的重復數(shù)目增加或減少，一代內(nèi)不會擴增至全突變，但可在更遠的世代傳遞中擴增為全突變，從而導致發(fā)病。前突變（premutation，PM）CGG 重復數(shù)目在 55 ~ 200 之間，無FXS 患病表現(xiàn)；全突變（full mutation，F(xiàn)M）CGG 重復擴增至 200 以上，部分重復數(shù)目達幾百甚至上千，F(xiàn)XS 特征表現(xiàn)明顯[2]。具體的1基因突變類型與發(fā)病關(guān)系如圖 1 所示。

圖 1 FMR1基因型與發(fā)病關(guān)系[3]

1995 年至今，我國共對 12 676 例智力低下患兒進行了脆性 X 綜合征的篩查，查出患兒共計 804 例，以此計算出脆性 X 綜合征在我國智力低下患兒中的患病率約為 6.3%[4]。鑒于該遺傳病患者生活不能自理、發(fā)病率較高且樣本獲得困難的特點，對臨床樣本的永生化細胞系的轉(zhuǎn)化和有效檢測方法的建立至關(guān)重要，可以為脆性 X 遺傳病和分子生物學研究提供長期穩(wěn)定的遺傳資源。目前國內(nèi)相關(guān)的研究，特別是脆性 X 綜合征永生化細胞系建立的報道較少。本研究的驗證方法采用熒光 PCR-毛細管電泳法和 Southern blot 法，Southern 印跡雜交是目前最主要的脆性 X 確診方法[5]，可診斷出全突變患者和 CGG 異常擴增次數(shù)較多的前突變攜帶者，但對擴增次數(shù)較少的前突變攜帶者或嵌合體攜帶者可能存在漏檢。因此采用熒光 PCR-毛細管電泳法和Southern blot 法相結(jié)合的檢測方法可保證驗證結(jié)果的全面及準確。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 取經(jīng)在中南大學家輝遺傳醫(yī)院確診患者的外周血 5 ml?；颊呔炇鹬橥鈺?。樣本信息詳見表 1。

表 1 10 例樣本信息

1.1.2 試劑和耗材 核酸提取試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；永生化細胞系建立所需試劑購自美國 Gibco 公司；參考品驗證所需試劑盒購自廣州市達瑞生物技術(shù)股份有限公司和北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司；NanoDrop 核酸蛋白測定儀為安捷倫公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 EBV 病毒液的制備 利用饑餓后的病毒細胞準備新鮮病毒液，RPMI1640 + 1× 雙抗，復蘇 1 株 B95-8 細胞株，接種于5 ml 20% FBS 和 80% RPMI1640 的培養(yǎng)基中，每隔 2 ~ 3 天補液一次，逐漸增加培養(yǎng)液到所需的用量，饑餓細胞 4 ~ 7 d 后，收集細胞在液氮及 37 ℃條件下反復凍融 3 次，2000 r/min 離心 10 min。取上清液用 0.2 μm 濾膜過濾后短暫放置于 4 ℃冰箱，最終于–70 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 脆性 X 綜合征患者淋巴細胞的分離 使用肝素抗凝管盛裝患者及親屬的外周靜脈全血 5 ml，將血液轉(zhuǎn)移到 Corning 離心管后加入 4 ml Ficoll 淋巴細胞分離液，加入等體積的含有青霉素及鏈霉素的 RPMI1640 培養(yǎng)液，2500 r/min 離心 30 min 后移取白色絮狀淋巴細胞至另一試管中，加入8 ml RPMI1640 洗滌 2 次，800 r/min 離心 10 min 備用。

1.2.3 脆性 X 綜合征患者淋巴細胞的永生化轉(zhuǎn)化 將分離出的細胞用 8 ml RPMI1640 培養(yǎng)基洗滌 2 次后，在800 r/min 條件下離心10 min 去上清，加入 EBV病毒液1.5 ml，環(huán)孢菌素 A 0.4 ml（200 μg/ml 母液，最終作用濃度 2 μg/ml），混勻后等份轉(zhuǎn)入 2 個 10 ml 培養(yǎng)瓶中，置于 37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 24 ~ 48 h 后，使用倒置顯微鏡觀察細胞轉(zhuǎn)化情況并拍照，根據(jù)細胞轉(zhuǎn)化和聚集情況進行加液或半量換液，當細胞數(shù)達到（3 ~ 6）× 106個/ml 時將細胞吹勻，1500 r/min 離心 5 min 后用凍存液重懸并置于凍存管中凍存。

1.2.4 脆性 X 綜合征患者永生化細胞系的凍存 在細胞株凍存前 24 h 換液；將細胞培養(yǎng)物收集至 10 ml 離心管中，1200 r/min 離心 10 min，棄上清，根據(jù)細胞的數(shù)量加入一定量的凍存液（30% 胎牛血清、70% RPMI1640、10% 二甲基亞砜，過濾滅菌，–20 ℃避光保存），分裝在凍存管中，每管1 ml 凍存液，置–20 ℃ 2 h 后置于–70 ℃，2 h 后放入液氮中保存。

1.2.5 脆性 X 綜合征患者永生化細胞系的分子生物學檢驗 將脆性 X 綜合征患者永生化細胞系取出復蘇后進行 DNA 提取，再進行熒光 PCR-毛細管電泳法和 Southern blot 法的驗證檢驗。

2 結(jié)果

2.1 脆性 X 綜合征患者淋巴細胞的永生化轉(zhuǎn)化顯微鏡驗證結(jié)果

10 份細胞株樣本在復蘇并培養(yǎng) 7 d 時，在倒置顯微鏡下可觀察到光滑透亮的淋巴細胞明顯發(fā)生增大、聚團，且細胞周邊有較多的胞質(zhì)突出（圖 2）；30 d 時，顯微鏡下可觀察到淋巴細胞生長形成密集的細胞團且外壁有不規(guī)則毛刺狀突起（圖 3），表明細胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞樣 B 細胞，表明轉(zhuǎn)化成功。

2.2 脆性 X 綜合征患者永生化細胞系分子生物學驗證結(jié)果

將 10 份永生化細胞株樣本用核酸提取試劑盒進行 DNA 抽提，提取的 DNA 用NanoDrop 核酸蛋白測定儀測定260/280和260/230值并用瓊脂糖凝膠電泳膠檢驗 DNA 的完整性，NanoDropTMOne 對 DNA 進行精確定量；對 DNA 樣本進行熒光 PCR-毛細管電泳法及Southern blot 法檢驗分析，分析結(jié)果顯示全部陽性樣本的堿基序列與樣本 CGG 重復數(shù)一致。檢測結(jié)果見表 2、圖 4、圖 5。

圖 2 永生化細胞系轉(zhuǎn)化第 7 天結(jié)果（40 ×）

圖 3 永生化細胞系轉(zhuǎn)化第 30 天結(jié)果（100 ×）

表 2 10 份脆性 X 樣本永生化細胞系驗證結(jié)果

注：該 10 份脆性 X 永生化細胞系樣本為建系成功后液氮凍存的樣本。

圖 4 10 份脆性 X 樣本永生化細胞系熒光 PCR-毛細管電泳法結(jié)果

圖 5 10 份脆性 X 樣本永生化細胞系 Southern blot 法結(jié)果

3 討論

建立具有人類全基因組的永生化淋巴細胞系，是人類重要疾病遺傳資源保存與收集的主要技術(shù)手段和首選方法[6]。目前世界上具有較大影響力的基因細胞遺傳資源存儲機構(gòu)包括英國生物樣本庫（The UK Biobank）、美國國立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health，NIH）和美國國家人類基因細胞庫（The NIGMS Human Genetic Cell Repository），它們均是以永生化淋巴細胞系作為最主要的技術(shù)方法保存細胞遺傳資源[7]。建立永生化淋巴細胞系的優(yōu)點明顯：樣本用量較少，由 EBV 轉(zhuǎn)化外周血 B 淋巴細胞建立永生細胞株的方法規(guī)范[8]；連續(xù)培養(yǎng)傳代過程中染色體穩(wěn)定；細胞建系和培養(yǎng)成本較低；重要的是可獲得取之不盡的細胞遺傳資源用于遺傳性疾病的研究[9]。

本研究采用經(jīng)肝素抗凝的脆性 X 綜合征各突變類型的外周全血樣本，通過反復研究采用了（1 ~ 5）× 105個/ml 低密度接種轉(zhuǎn)化細胞，減少了 T、B 細胞的接觸機會；加入環(huán)孢素 A（終濃度 1 μg/ml）抑制了 T 細胞活性，最終成功建立了脆性 X 綜合征各類型樣本的外周血永生化細胞系，且成功進行了傳代、凍存和復蘇。同時對建系成功的永生化細胞株進行了可精確讀取 CGG 重復數(shù)量的熒光 PCR-毛細管電泳和脆性 X 檢測經(jīng)典方法的 Southern blot 法驗證，結(jié)果表明脆性 X 基因組 DNA 遺傳穩(wěn)定，可作為寶貴的樣本資源，為檢測試劑盒生產(chǎn)企業(yè)和科研機構(gòu)相關(guān)標準物質(zhì)的研制及后續(xù)的脆性 X 綜合征臨床檢驗與疾病控制奠定堅實的基礎(chǔ)。

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*同為第一作者

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.05.015

中國食品藥品檢定研究院中青年發(fā)展研究基金（2017C1）

黃杰，Email：jhuang5522@126.com；夏昆，Email：xiakun@ sklmg.edu.cn

2019-08-13