熒光探針PCR技術(shù)診斷小兒呼吸道合胞病毒(RSV)的效果觀察

聶曼杰

急性呼吸道感染是小兒時期的常見疾病,臨床數(shù)據(jù)[1]統(tǒng)計顯示95%以上的小兒急性呼吸道感染是由病毒導(dǎo)致的,而呼吸道合胞病毒(RSV)就是引發(fā)急性呼吸道感染的常見病毒之一。RSV感染主要是由于眼、口、鼻等部位的黏膜接觸導(dǎo)致的,其中嬰幼兒感染率更高[2-3]。隨著病情的發(fā)展,小兒RSV感染除了上呼吸道感染,還可能導(dǎo)致肺炎、支氣管炎等下呼吸道感染[4]。不同種類病原體的呼吸道感染的治療方法不同,有效的病原體檢測分類能為臨床的準確治療提供參考依據(jù)[5]。病毒分離培養(yǎng)是檢測RSV感染的金標準,但是操作繁瑣耗時,需要10 d左右才能得到檢測結(jié)果,且檢測費用高,臨床應(yīng)用受限。免疫熒光技術(shù)是目前檢測RSV感染的常用方法,它是通過將抗原抗體特異結(jié)合的免疫學(xué)方法聯(lián)合熒光標記技術(shù)進行檢測的方法,但是檢測RSV感染的特異度不夠理想[6]。聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增技術(shù)是能對病原體的核酸分子進行定性和定量檢測的一種方法。近年來,隨著相關(guān)研究的不斷深入,熒光探針PCR技術(shù)結(jié)合了PCR擴增反應(yīng)和熒光標記的技術(shù),是一種衍生的PCR技術(shù),它在病毒感染性疾病的診斷中逐漸有所應(yīng)用[7]。本次研究對熒光探針PCR技術(shù)檢測小兒RSV感染的結(jié)果進行分析?，F(xiàn)報告如下。

1 對象與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2019年1月我院兒科收治的175 例呼吸道感染患兒作為研究對象,其中男103例,女72例,年齡0.3～10歲,平均年齡(4.7±1.3)歲,病程4 d ～2 個月,平均病程(1.3±0.4)個月,其中急性支氣管肺炎67例,毛細支氣管炎71例,小兒哮喘37例。

1.2 方法 采用痰液收集器收集所有患兒的鼻咽吸出物,存貯于儲液器內(nèi),使用Hank液進行吹打混勻后,以1 000 r/min的速度離心5 min,吸取上清液,并保存在－80 ℃環(huán)境下備用待檢。所有受檢的患兒均分別采用免疫熒光技術(shù)和熒光探針PCR技術(shù)檢測患兒RSV感染的情況,并以病毒培養(yǎng)法進行明確診斷。

1.2.1 免疫熒光技術(shù)檢測 吸取500 μL的鼻咽吸出物樣本,加入5～8 mL的磷酸緩沖鹽溶液,先置入旋渦混合器震蕩3～5 min進行混合均勻,再以300～500 r/min的離心速度離心10 min。去除上清液后,收集下面的沉淀物再次加入5～8 mL的磷酸緩沖鹽溶液并重復(fù)震蕩和離心的操作。再次收集沉淀物后加入一定的磷酸緩沖鹽溶液調(diào)成1.0×106的細胞懸液。吸收25 μL的細胞懸液加入8孔載玻片中,37 ℃條件下待其干燥后使用冷丙酮固定10 min。接著在玻片上滴加熒光抗體染色,室溫下進行孵育0.5 h。然后采用磷酸鹽吐溫緩沖液連續(xù)沖洗3次玻片后再采用蒸餾水進行沖洗,去除多余的沖洗液,最后待玻片徹底干燥后在每個細胞點上加上1滴封片劑進行封片。在德國蔡司公司的AXIOVERT 40型熒光顯微鏡下觀察載玻片上細胞點內(nèi)的熒光情況。以出現(xiàn)熒光蘋果綠視為PSV感染陽性,否則視為陰性。

1.2.2 免疫探針PCR 技術(shù)檢測 吸取150 μL的鼻咽吸出物樣本,選用德國Qiagen 公司的QIAmpRNA Mini Kit病毒RNA提取試劑盒按照其說明書進行提取樣本中的病毒RNA。根據(jù)探針設(shè)計原則選擇的引物為,上游：RSV-F：5'-GGA CAA GTT G TT GAG GTT TAT GAA TAT GC-3',下游：RSV-R：5'-T TC TGC TGT CAA GTC TAG TACACT GTA GT-3'。采用隨機合成的引物將提取到的RNA合成cDNA,選用美國ABI公司的7500型熒光PCR儀放入反應(yīng)管進行PCR擴增反應(yīng),設(shè)置的反應(yīng)條件為：①42 ℃,8 min預(yù)變性。②94 ℃,30 s,55 ℃,30 s,72 ℃,45 s,35個循環(huán)。熒光素設(shè)定FAM,反應(yīng)結(jié)束后通過擴增Ct值判斷結(jié)果。

1.3 觀察指標 統(tǒng)計免疫熒光技術(shù)和熒光探針PCR技術(shù)進行檢測患兒RSV感染的情況,以病毒培養(yǎng)法的RSV感染結(jié)果作為診斷的金標準,比較免疫熒光技術(shù)和熒光探針PCR技術(shù)檢測診斷患兒RSV感染的靈敏度、特異度以及準確性等診斷效能。靈敏度＝真陽性人數(shù)/(真陽性人數(shù)＋假陰性人數(shù))×100%。特異度＝真陰性人數(shù)/(真陰性人數(shù)＋假陽性人數(shù)) ×100%。準確性＝(真陰性人數(shù)＋真陽性人數(shù))/(真陰性人數(shù)＋假陰性人數(shù)＋真陽性人數(shù)＋假陽性人數(shù))×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析,診斷效能等計數(shù)資料采用率表示,組間差異采用卡方檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種檢測方法診斷RSV感染的結(jié)果比較(表1)175例呼吸道感染患兒中RSV感染陽性103例,其中男64例,占比62.14%,女39例,占比37.86%。免疫熒光技術(shù)檢測診斷患兒RSV感染陽性98例,其中真陽性88例,熒光探針PCR技術(shù)檢測診斷患兒RSV感染陽性104例,其中真陽性102例。

2.2 兩種檢測方法診斷RSV感染的診斷效能比較(表2) 免疫熒光技術(shù)檢測診斷患兒RSV感染的靈敏度、特異度以及準確性分別為85.44%、86.11%、85.71%。熒光探針PCR技術(shù)檢測診斷的靈敏度、特異度以及準確性分別為99.03%、97.22%、98.29%,兩者相比熒光探針PCR技術(shù)檢測診斷患兒RSV感染的各項診斷效能均優(yōu)于免疫熒光技術(shù)檢測,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 兩種檢測方法診斷RSV感染的結(jié)果比較(n)

表2 兩種檢測方法診斷RSV感染的診斷效能比較 單位：%

3 討論

數(shù)據(jù)統(tǒng)計,目前國內(nèi)每年死于急性呼吸道感染的患兒約有10萬,其中在部分經(jīng)濟發(fā)展較為滯后的省市急性呼吸道感染患兒的病死率更高,嚴重影響兒童的身體健康和生命安全[8]。根據(jù)感染病原體的不同,主要分為細菌感染和病毒感染,以后者的占比更大,高達90%。其中RSV是導(dǎo)致兒童急性呼吸道感染的常見病原體,也是目前全球范圍內(nèi)公認的誘發(fā)兒童急性肺炎和毛細支氣管炎的最為主要的病原體[9]。在發(fā)生RSV呼吸道感染時,缺乏特異性的臨床癥狀及表現(xiàn),依靠其進行鑒別診斷的難度較高[10]。免疫學(xué)檢測是RSV呼吸道感染檢測的常用方法,免疫熒光技術(shù)應(yīng)用于病毒抗體的檢測已有30多年的歷史,它通過對RSV病毒的特異性單克隆抗體采用熒光素標記后,利用抗體和病毒表面抗原的特異性結(jié)合的特點,在熒光顯微鏡下觀察兩者結(jié)合后的免疫復(fù)合物的熒光情況,從而對樣本細胞中的病毒抗原和抗體進行準確定位和定量分析[11]。既往研究[12]顯示,免疫熒光技術(shù)檢測RSV病毒容易受到其他交叉抗原的影響,存在一定的假陽性或假陰性比例。PCR技術(shù)屬于分子生物學(xué)檢測方法,具有靈敏度高、漏檢率低的特點,且PCR檢測的速度快,能顯著縮短窗口期的檢測時間[13]。而熒光PCR技術(shù)結(jié)合了PCR和熒光探針兩種技術(shù),在PCR擴增反應(yīng)體系中加入了熒光素染色劑,通過觀察熒光信號直接進行模板濃度的定量分析,解決了傳統(tǒng)PCR無法實時監(jiān)控的問題,還能減少傳統(tǒng)PCR中電泳、照相等操作中污染的發(fā)生率。另外熒光PCR技術(shù)結(jié)合探針法的特異性,靶序列受到引物和探針的雙重控制,能減少非特異性擴增,進一步提高檢測的特異度[14]。本次研究中,免疫熒光技術(shù)檢測診斷患兒RSV感染的靈敏度、特異度以及準確性均低于熒光探針PCR技術(shù)檢測診斷的靈敏度、特異度以及準確性,而探針PCR技術(shù)各項診斷效能均優(yōu)于免疫熒光技術(shù)檢測,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果與俞松山等[15]的研究一致,顯示相較免疫熒光技術(shù)檢測小兒RSV感染相比,熒光探針PCR技術(shù)檢測能有效避免免疫學(xué)檢測中抗原的血清學(xué)交叉反應(yīng)帶來的假陽性和假陰性,從而提高診斷的靈敏度和準確度。

綜上所述,相較免疫熒光技術(shù)檢測小兒RSV感染相比,熒光探針PCR技術(shù)檢測的靈敏度和準確度更好,具有臨床推廣的價值。