玉米種子純度SSR分子標(biāo)記檢測(cè)研究報(bào)告

李世聰 朱華國(guó) 薛飛

摘 ? 要：本試驗(yàn)利用SSR分子標(biāo)記法，對(duì)玉米雜交種金慶707和世賓338玉米雜交種的種子純度進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明：8對(duì)SSR引物bnlg1940k7、 phi053k2、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg2305k4、bnlg1702k1、phi080k15和umc1492y13可用于金慶707種子純度鑒定;8對(duì)SSR引物umc2105k3、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg161k8、bnlg1702k1、umc1545y2、phi080k15和umc1432y6可用于品種世賓338種子純度鑒定。選用引物phi053k2檢測(cè)金慶707的種子純度為92%，選用引物bnlg1702k1檢測(cè)世賓338的種子純度為66%，兩者均未達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。本研究從玉米20對(duì)SSR核心引物中篩選出8對(duì)多態(tài)性引物可用于金慶707和世賓338兩個(gè)品種的種子純度檢測(cè)，大大縮短了種子純度檢測(cè)的周期。

關(guān)鍵詞：SSR分子標(biāo)記;玉米雜交種;種子純度

玉米是我國(guó)一種很重要的糧食作物，也是飼料加工的重要來(lái)源，在我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中處于很重要的位置[1]。種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最根本的生產(chǎn)資料，種子質(zhì)量的好壞決定了農(nóng)作物產(chǎn)量的多少和品質(zhì)的優(yōu)良，而種子純度的高低又是顯示種子質(zhì)量好壞的一項(xiàng)重要因素[2]。種子純度的檢測(cè)是發(fā)揮作物產(chǎn)量潛能和保證作物質(zhì)量的必要措施。根據(jù)前人的研究，種子純度下降1個(gè)百分點(diǎn)，將會(huì)直接導(dǎo)致作物產(chǎn)量減少大約1%[3]。種子市場(chǎng)的不規(guī)范，對(duì)育種者、種植戶以及經(jīng)銷商的利益造成極大的損害。新疆是中國(guó)的農(nóng)業(yè)大省，種子市場(chǎng)的“多亂混雜”，嚴(yán)重危害到育種者、種植戶以及經(jīng)銷商的利益，所以種子純度的鑒定十分必要。種子純度鑒定的方法主要包括田間形態(tài)鑒定和生化標(biāo)記鑒定及DNA分子標(biāo)記鑒定等[4]。

最初的田間形態(tài)鑒定，存在鑒定周期長(zhǎng)、結(jié)果受環(huán)境影響較大、準(zhǔn)確性差等缺點(diǎn)[5];生化標(biāo)記鑒定是利用不同品種蛋白質(zhì)的不同得以鑒定，蛋白質(zhì)電泳鑒定容易遭受環(huán)境和生長(zhǎng)狀況的影響。陳皆輝[6]、張承毅[7]等人利用生化標(biāo)記鑒定的方法快速準(zhǔn)確地將不同品種分開(kāi)。相比之下，SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、呈共顯性、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[8]。SSR分子標(biāo)記法已廣泛應(yīng)用于各種農(nóng)作物的真實(shí)性以及純度鑒定，李苗[9]、

劉宏魁[10]、李陽(yáng)[11]等人利用多態(tài)性SSR引物對(duì)玉米種子純度和指紋圖譜進(jìn)行了分析。吳明生[12]等人利用SSR標(biāo)記檢測(cè)了辣椒的種子純度。對(duì)玉米種子純度進(jìn)行檢測(cè)，利于玉米種子市場(chǎng)的監(jiān)管、保障生產(chǎn)者和經(jīng)營(yíng)者的利益。

本研究從玉米20對(duì)SSR引物中篩選出可用于金慶707和世賓338兩個(gè)玉米品種純度鑒定的特異性引物，并利用特異性引物對(duì)金慶707和世賓338抽樣種子進(jìn)行純度鑒定。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 材料

試驗(yàn)材料：金慶707雜交種及其父母本種子、世賓338及其父母本種子，20對(duì)SSR引物序列來(lái)自數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.maizegdb.org/）。

試劑：氯仿、SDS提取液、異丙醇、5mol/L氯化鈉溶液、β-巰基乙醇、70%乙醇、TE緩沖液、ddH2O、10×Buffer、MgCl2、dNTP、Taq酶、引物、95%乙醇。

1.2 ? 試驗(yàn)方法

1.2.1 ? SDS法提取玉米種子的DNA

參考郭景倫等[13]的方法，提取玉米DNA，每個(gè)品種隨機(jī)選取50粒種子提取種子胚中的DNA。

1.2.2 ? SSR引物篩選及純度鑒定

選取玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T 2475-2013中公布的20對(duì)玉米SSR引物，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。以金慶707和世賓338父母本基因組DNA為模板，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增和8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，在20對(duì)SSR引物中篩選出能夠明顯區(qū)分父母本的多態(tài)性引物。

PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2μL，2.5mM dNTPs1.2μL，上下游引物10μM各0.25μL，5U/μLTaq DNA聚合酶0.2μL，模板DNA2μL，無(wú)菌水補(bǔ)全到20μL。SSR的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min，94℃變性45s，引物退火溫度退火45s，72℃延伸45s，共35個(gè)循環(huán);72℃延伸10min，PCR產(chǎn)物保存于4℃。反應(yīng)程序的反應(yīng)時(shí)間、溫度、次數(shù)等可根據(jù)PCR儀器、酶以及引物等的不同作出相應(yīng)的調(diào)節(jié)。

擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（150V60～80min）分離，銀染顯色，觀察記錄。

1.2.3 ? 數(shù)據(jù)記錄

檢測(cè)樣品與對(duì)照樣品（父本、母本）在同一電泳板上并排電泳時(shí)，將檢測(cè)樣品與對(duì)照樣品兩兩比較，并標(biāo)記每個(gè)位點(diǎn)的異同情況。

2 ? 結(jié)果與分析

2.1 ? 用于金慶707和世賓338純度鑒定的多態(tài)性SSR引物篩選

20對(duì)SSR引物對(duì)金慶707和世賓338父母本DNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果分別見(jiàn)圖1、圖2。在金慶707親本間擴(kuò)增產(chǎn)物具有明顯差異的引物有bnlg1940k7、phi053k2、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg2305k4、bnlg1702k1、phi080k15、umc1492y13共8對(duì)SSR引物，在世賓338親本間擴(kuò)增產(chǎn)物具有明顯差異的引物有umc2105k3、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg161k8、bnlg1702k1、umc1545y2、phi080k15、umc1432y6共8對(duì)SSR引物。

2.2 ? 金慶707種子純度鑒定

從篩選出的8對(duì)可用于金慶707種子純度鑒定的引物中選用引物phi053k2對(duì)金慶707及其父母本基因進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)電泳條帶的分析可以得出金慶707種子樣本的純度。結(jié)果如圖3所示，所抽種子檢測(cè)樣品樣本有3種類型：雜交種金慶707種子、父本自交系種子和母本自交系種子。根據(jù)公式計(jì)算，本批金慶707種子純度為92%，其中有4%的父本自交系雜種，4%的母本自交系雜種。

2.3 ? 世賓338種子純度鑒定

選用引物bnlg1702k1對(duì)世賓338及其父母本DNA進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)抽樣批次世賓338種子樣本的種子純度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示，所抽種子檢測(cè)樣品樣本有2種類型：雜交種種子和母本自交系種子。經(jīng)過(guò)計(jì)算，本批世賓338的種子純度為66%，含有34%的母本自交系雜種。

3 ? 討論

本研究從20對(duì)玉米SSR引物中篩選出多態(tài)性引物，對(duì)金慶707和世賓3382個(gè)品種的種子純度進(jìn)行了檢驗(yàn)。劉勤紅[14]、盧虹[15]、李汝玉等[16]采用了SSR分子標(biāo)記的方法，分別在棉花、油菜和玉米等作物的種子純度上進(jìn)行研究，并且得到的結(jié)果與傳統(tǒng)田間鑒定相符合。結(jié)合前人大量試驗(yàn)和本試驗(yàn)的結(jié)果表明，SSR分子標(biāo)記法在玉米和其他作物的種子純度鑒定中都能夠取得良好的結(jié)果。

4 ? 結(jié)論

本試驗(yàn)利用SSR分子標(biāo)記法對(duì)2個(gè)玉米雜交種金慶707和世賓338進(jìn)行了種子純度鑒定。金慶707玉米雜交種抽樣批次的種子純度為92%， 世賓338玉米雜交種抽樣批次的種子純度為66%，都未達(dá)到玉米單交種大田用種96.0%的種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。

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（收稿日期：2019-03-31）