常見動(dòng)物原蟲病的顯微鏡快速檢查方法

朱石瓊 魯富有 解明華 劉桂伶 張容萍 陳俊秀 彭海生

1.云南省普洱市寧洱縣勐先鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，云南普洱 665104；2.云南省普洱市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南普洱 665000；3.云南省普洱市寧洱縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南普洱 665199；4.云南省普洱市景谷縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南普洱 666400

動(dòng)物原蟲病比較繁多，分布十分廣泛，特別是血液原蟲病、球蟲病和附紅細(xì)胞體?。ìF(xiàn)列為立克次氏體），對畜禽養(yǎng)殖業(yè)危害極大。近年來，此類疫病的發(fā)病呈上升趨勢，部分病已呈局部流行。特別是豬、牛、馬、羊的焦蟲病，呈急性或慢性消耗性發(fā)病死亡，給廣大養(yǎng)殖戶造成了很大損失。近年來，筆者采用顯微鏡快速檢查診斷方法，結(jié)合流行病學(xué)等綜合分析，對10多例的動(dòng)物原蟲病作出診治，為廣大養(yǎng)殖戶挽回了經(jīng)濟(jì)損失。

1 原蟲

1.1 形態(tài)結(jié)構(gòu)

原蟲是單細(xì)胞動(dòng)物，整個(gè)蟲體由1個(gè)細(xì)胞構(gòu)成。分類上屬于原生生物界，原生動(dòng)物亞界。同高等動(dòng)物的細(xì)胞一樣，原蟲具有細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核等主要細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

在光電顯微鏡下，原蟲細(xì)胞核外表變化很大，除纖毛蟲外，大多數(shù)均為囊泡狀，其特征為染色質(zhì)分布不均勻，在核液中出現(xiàn)明顯的清亮區(qū)，染色質(zhì)濃縮于細(xì)胞核的周圍區(qū)域或中央?yún)^(qū)域。有1個(gè)或多個(gè)核仁。核內(nèi)體明顯，與核仁相似，但在有絲分裂過程中不消失。

原蟲有4種運(yùn)動(dòng)器官：鞭毛、纖毛、偽足和波動(dòng)嵴。鞭毛很細(xì)，呈鞭子狀，鞭毛的大部分可能包埋在蟲體一側(cè)延伸出來的細(xì)胞膜中，從而形成一個(gè)鰭狀波動(dòng)膜，如伊氏錐蟲；纖毛的結(jié)構(gòu)與鞭毛相似，但數(shù)目更多；偽足是肉足鞭毛亞門蟲體的臨時(shí)性器官，可以引起蟲體運(yùn)動(dòng)以捕獲食物；波動(dòng)嵴是孢子蟲定位的器官，只有在電鏡下才能觀察到。此外，原生動(dòng)物還有一些特殊細(xì)胞器，即動(dòng)基體和頂復(fù)合器。

1.2 生殖方式

原蟲的生殖方式分無性生殖和有性生殖2種。

1）無性生殖。二分裂生殖：即1個(gè)蟲體分裂為2個(gè)，分裂方式有縱二分裂和橫二分裂。裂殖生殖：也稱復(fù)分裂，細(xì)胞核和基本細(xì)胞器先分裂數(shù)次，而后細(xì)胞質(zhì)分裂、同時(shí)產(chǎn)生大量子代細(xì)胞。裂殖生殖中的蟲體稱為裂殖體，1個(gè)裂殖體內(nèi)可包含數(shù)十個(gè)裂殖子。孢子生殖：是配子形成的合子所進(jìn)行的復(fù)分裂，經(jīng)孢子生殖、孢子體可以形成多個(gè)子孢子。出芽生殖：即先從母細(xì)胞邊緣或細(xì)胞內(nèi)分裂出1個(gè)或數(shù)個(gè)小的子個(gè)體，逐漸變大成單獨(dú)個(gè)體。

2）有性生殖。有結(jié)合生殖和配子生殖2種基本類型。結(jié)合生殖：多見于纖毛蟲，2個(gè)蟲體并排結(jié)合，進(jìn)行核質(zhì)的交換，核重建后再分裂為含有新核的蟲體。配子生殖：因?yàn)橄x體在裂殖生殖過程中出現(xiàn)性的分化，一部分裂殖體形成大配子體（雌性），一部分形成小配子體（雄性）。1個(gè)小配子體發(fā)育成熟后可以產(chǎn)生多個(gè)小配子，1個(gè)大配子體只產(chǎn)生1個(gè)大配子。小配子進(jìn)入大配子體內(nèi)結(jié)合形成合子，合子可以再進(jìn)行孢子生殖。

1.3 宿主與寄生部位

絕大多數(shù)動(dòng)物原蟲?。ㄗ∪怄咦酉x除外）是由各種不同的原蟲寄生于各種動(dòng)物細(xì)胞或造血器官引起的。其宿主可以有1個(gè)或2個(gè)（如球蟲）。原蟲的中間宿主以蜱螨和吸血昆蟲為主，如螫蠅、蠓、蚋、虻、虱等。

1.4 蟲體大小及檢查

1）蟲體大小。引起動(dòng)物發(fā)病的原蟲十分微小，大小0.2～20.0 μm，人的肉眼不能直接觀察到，必須借助光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡將其放大后，才能觀察到蟲體或其蟲卵的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。普通光電顯微鏡，可以將血原蟲或細(xì)菌放大至1 000倍（100倍物鏡和10倍目鏡聯(lián)合放大），達(dá)到0.2～2.0 mm后，肉眼可以觀察。血液原蟲一般為無色半透明，經(jīng)過染色后可在顯微鏡下清晰觀察到其形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2）原蟲的快速檢查。主要是采取血液（或胸腹腔液、糞便處物）涂片染色鏡檢。臨床上較常用的有革蘭氏染色、瑞特氏染色、姬姆薩染色、美藍(lán)染色等。血液涂片染色鏡檢適用于血孢子蟲引起的寄生蟲病，如豬、牛、羊、馬、犬焦蟲，牛、馬、羊伊低錐蟲，多種動(dòng)物附紅細(xì)胞體（屬立克次氏體）；弓形蟲采取胸腹腔積液涂片或病料觸片染色鏡檢；球蟲可采集病變部位腸內(nèi)糞便處理后的漂浮物，涂片檢查球蟲卵。采取相應(yīng)的樣品涂片染色和顯微鏡檢，可以簡單、快速和準(zhǔn)確地診斷動(dòng)物原蟲病，在臨床診斷上具有重要意義。

2 檢查樣品涂片的制作

2.1 玻片要求

載玻片的大小、厚度等參數(shù)要符合國家標(biāo)準(zhǔn)。玻片要求完好無缺損，新開封的玻片不用清洗，使用時(shí)在酒精燈火焰上來回烘烤一下，以除去玻片上的水分和部分有機(jī)質(zhì)，使玻片干燥透亮。舊玻片要用清潔劑清洗干凈并干燥后使用，使用前最好也用酒精棉球火焰烘烤一下。

2.2 樣品檢查步驟

清潔干燥玻片→血液（病料）涂片→自然干燥→甲醇（或火焰）固定→涂片染色（有的可不染色）→顯微鏡檢→顯微圖片采集→記錄。

2.3 樣品的采集

血液涂片應(yīng)當(dāng)采自于活體或?yàn)l死期動(dòng)物末稍血液或靜脈血，死亡時(shí)間較長的血液檢出率會(huì)降低，或因蟲體死亡或自溶而不能檢出。胸腹腔液采于致死或死亡時(shí)間很短的動(dòng)物體腔。發(fā)病后未經(jīng)治療的動(dòng)物檢出率更高。采樣時(shí)必須注意，現(xiàn)場不能涂片的可用EDTA抗凝管，或用EDTA-K2抗凝管采集末稍血或靜脈血，冷藏保存，稍后涂片。

2.4 病料涂片制作

1）組織病料涂片或觸片：盡量在無菌條件下剪開新鮮的組織病料，輕輕觸片或涂在干燥、潔凈的玻片中央，編號(hào)后使之自然干燥，備用。

2）血液涂片：用吸管或移液器現(xiàn)場采集發(fā)病動(dòng)物的新鮮全血，或用EDTA、或EDTA-K2抗凝管采集保存的抗凝血少許（5～10 μL），于潔凈玻片近端約1/3的中央，用另一玻片一端約45°向前推約2 cm，即成血液涂片，使之自然干燥，備用。臨床實(shí)踐中，在現(xiàn)場用玻片的一角，直接蘸取末稍血（或適檢血）一小滴，于玻片近端1/3處，玻片斜偏使血液成一直線后，于30°～45°向前推約2 cm即成。同一待檢血樣要同時(shí)制作血片3～5片備用，并做好編號(hào)。

3）胸腹腔液涂片制作：如弓形蟲的包囊、滋養(yǎng)體檢查，用無菌微量吸管或注射器，吸取胸腹腔液于玻片中央，輕輕涂抹均勻，形成薄膜，使之自然干燥，備用。

4）球蟲及蟲卵檢查涂片制作：急性死亡病例可從病變部位刮取少量黏膜置于載玻片上，加1～2滴生理鹽水混勻，加蓋玻片用高倍鏡檢查。或刮取少量腸黏膜做成涂片，用姬氏或瑞氏液染色，在高倍鏡下檢查，若見到有大量裂殖體和裂殖子即可確診。病畜禽采集病變部位腸內(nèi)糞便5～10 g于100 mL燒杯中（或離心管中），加無菌水約50 mL攪拌使之沉淀，然后棄上清液，沉渣內(nèi)加入飽和氯化鈉溶液或飽和硫酸鎂溶液，攪拌均勻后，取表層漂浮液于玻片上鏡檢，若見有大量卵囊即可確診?；蛭∩倭坑诓Ｆ醒胼p輕涂勻，形成均勻薄片，干燥，染色，鏡檢。為加快檢查時(shí)間，糞便處理溶液2 000 r/min離心，取上浮物檢查，效果更好。

5）注意事項(xiàng)：涂片時(shí)必須細(xì)心操作，涂片要薄且均勻，盡快干燥，防止涂片粘連或腐敗。

6）涂片的固定：自然干燥的涂片在染色前必須固定。酒精燈火焰固定：玻片背面在酒精燈火焰上來回3～5次，溫度不宜過高，以玻片背面接觸手背溫?zé)釣闇?zhǔn)，否則可能使病原形態(tài)改變，影響觀察結(jié)果；甲醇固定：用吸管或移液器取分析純甲醇滴于涂片上，以充分覆蓋病料涂層為準(zhǔn)，使之自然干燥后才能染色。

3 染色液配制與染色方法

3.1 革蘭氏染色液配制

革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，可用于標(biāo)本涂片或菌落涂片，染色后細(xì)菌與環(huán)境形成鮮明對比，可以清晰觀察到細(xì)菌的形態(tài)、排列及某些結(jié)構(gòu)特征，主要用于臨床分類鑒定。臨床實(shí)踐中，也可用來染色血液原蟲。革蘭氏染色是由草酸銨結(jié)晶紫染液、碘溶液、脫色劑（乙醇）和沙黃染液4種染色液組成，按先后順序（紫、碘、脫、黃）進(jìn)行復(fù)合染色。

1）結(jié)晶紫染液：結(jié)晶紫5 g，95%乙醇100 mL，1%草酸銨水溶液400 mL，按先后順序溶解混合，濾紙過濾后保存于棕色試劑瓶中備用。

2）碘溶液：碘（片）1 g，碘化鉀2 g，蒸餾水 300 mL，溶解，保存于棕色試劑瓶中備用。

3）脫色劑為95%乙醇。

4）沙黃染液：沙黃 1.0 g，95%乙醇 40 mL，蒸餾水360 mL保存于試劑瓶中備用。

3.2 染色方法

染色方法共包括以下6個(gè)步驟：

1）先加結(jié)晶紫染色液，初染1～2 min，用純凈水或自來水緩緩沖洗后甩干。

2）加革蘭氏碘液，媒染1～2 min，緩緩沖洗后甩干。

3）加95%乙醇，脫色10～20 s，緩緩沖洗后甩干。

4）加復(fù)紅染液復(fù)染（沙黃復(fù)紅染液或者石碳酸復(fù)紅染液）1～2 min，沖洗后使之自然干燥，或用吸水紙、中性濾紙吸干。

5）顯微鏡檢：革蘭氏陽性細(xì)菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。

6）注意在染色時(shí)染色液可完全覆蓋玻片涂層，并在規(guī)定的染色時(shí)間內(nèi)保持液體不干為宜。

3.3 瑞氏染色液配制與染色

瑞氏染色液配制：取瑞氏染色素（粉）0.4 g（研磨），甲醇240 mL，充分溶解，濾紙過濾后，保存于棕色瓶中備用。

染色：適用于血液原蟲和附紅細(xì)胞體涂片的染色。用瑞氏染色液滴加在涂片上染色1～2 min，再加等量蒸餾水復(fù)染2 min，沖洗，干燥后鏡檢。

3.4 美藍(lán)染色液配制與染色

取美藍(lán)（亞甲基藍(lán)）1.2 g，95%乙醇120 mL，0.1%氫氧化鉀溶液400 mL，溶解混合后用濾紙過濾，保存于棕色瓶中備用。吸取染色液于涂片上染色2～3 min，沖洗干燥后鏡檢，蟲體呈藍(lán)色。

3.5 姬姆薩染色液配制與染色

取姬姆薩染色粉1.8 g，甘油150 mL，甲醇150 mL。先將姬姆薩染色粉與甘油混合，在55～60℃加溫1～2 h后，再加甲醇混合靜置1 d以上，用濾紙過濾后，置棕色瓶中備用（即為原液）。

姬姆薩染色（原液）的稀釋：使用時(shí)，原液按1∶4用中性蒸餾水稀釋后，即為工作染色液。

染色：適用于血液原蟲染色。工作液滴加在涂片上染色約30 min，或?qū)⒉Ｆ萌旧字信萑?0 min，沖洗、干燥后鏡檢。

3.6 瑞氏-姬姆薩復(fù)合染色液

瑞氏-姬姆薩染色液，是利用瑞氏改良技術(shù)原理改良而成，適用于血液原蟲涂片的染色。細(xì)胞的著色是染料透入被染物并存留其內(nèi)部的過程，此過程既有物理吸附作用，又有化學(xué)親合作用。各種細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的各種成分由于其化學(xué)性質(zhì)不同，對瑞氏-姬姆薩染色液中的酸性染料(曙紅)和堿性染料（亞甲藍(lán)）的親合力也不同。因此，涂片經(jīng)瑞氏-姬姆薩染色液染色后，相應(yīng)各類細(xì)胞呈現(xiàn)不同的著色，從而達(dá)到辨別其形態(tài)特征的目的。這種復(fù)合染色液可在市場上買到，染色時(shí)間短，只需3～5 min，染色效果好，價(jià)格便宜，在檢驗(yàn)工作中經(jīng)常使用。

3.7 商品染色液

若上述染色液配制困難，可直接采購商品染色液，方便且簡單。目前許多實(shí)驗(yàn)室都采用商品化的染色液，如廣東珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的染色液品種齊全，質(zhì)量良好。

4 顯微鏡檢查

4.1 普通光電顯微鏡檢查

1）懸滴壓片檢查法。如豬、牛、羊、馬等動(dòng)物附紅細(xì)胞體檢查，可取新鮮血液少許于載玻片上，用微量液器加等量生理鹽水混合，加蓋玻片，在400～600倍低倍鏡、暗視野下仔細(xì)觀察多個(gè)視野，特別是玻片邊緣區(qū)聚集蟲體更多。附紅體附著在紅細(xì)胞表面，數(shù)量不等，紅細(xì)胞外形呈鋸齒狀排列，并可使動(dòng)物紅細(xì)胞翻轉(zhuǎn)或不規(guī)則運(yùn)動(dòng)，可確定為感染附紅細(xì)胞體。感染嚴(yán)重伊氏錐蟲者，也可用此法在2 h內(nèi)的新鮮血或抗凝血中查到，超過2 h蟲體會(huì)自行溶解。此外，球蟲處理漂浮物、疥螨等也可用此法檢查。

2）未染色血涂片鏡檢：血片涂好干燥后，未經(jīng)染色也可在600倍以上的紅細(xì)胞中檢查到焦蟲，但輪廓不太清晰，或在紅細(xì)胞表面檢查到清晰的附紅細(xì)胞體。

3）染色涂片檢查法。檢查前，首先準(zhǔn)備好性能良好和可正常使用的顯微鏡、擦鏡紙、香柏油或高級(jí)油鏡油。開啟顯微鏡電源5 min后，將染色干燥的玻片置于樣品臺(tái)上，調(diào)整物鏡、焦距、光源、濾光片等。先用10×10低倍鏡觀察視野中的物體，再依次用10×40、10×60的低倍鏡觀察到物體（血細(xì)胞或蟲體），再用10×100高倍鏡（油鏡）觀察，緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)微調(diào)至觀察物清晰時(shí)，滴加適量高級(jí)油鏡油或香柏油檢查，病原體的形態(tài)和著色情況會(huì)更加清晰。

油鏡常用的香柏油，能夠溶解復(fù)紅等染料，使染色退色，但容易干燥凝結(jié)，對油鏡造成損害，在發(fā)達(dá)國家已被禁用。目前國產(chǎn)的高級(jí)油鏡油可以取代香柏油，使用完后，用鏡頭紙直接擦干鏡頭即可，無需使用二甲苯清洗。

4.2 顯微圖片采集

有條件的實(shí)驗(yàn)室，可采用帶有照像系統(tǒng)的顯微鏡檢查。如投影顯微鏡、奧林巴斯CX31型生物顯微鏡檢查，并把顯微圖片采集下來作永久保存。無照相系統(tǒng)顯微鏡條件時(shí)，可用手機(jī)拍照。即將視野調(diào)到最清晰時(shí)，用像素高的手機(jī)對準(zhǔn)物鏡，輕輕調(diào)整到可清晰看到視野時(shí)拍照即可，這是筆者在多年工作實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)的一種既方便又快速的圖片保存方法。

4.3 部分動(dòng)物原蟲的顯微鏡圖片

圖1～圖10均為筆者采集到的部分動(dòng)物原蟲的顯微鏡圖片，包括焦蟲、附紅細(xì)胞體、弓形蟲和球蟲，供同行在臨床實(shí)踐中參考。

圖1 豬焦蟲

圖2 山羊焦蟲

圖3 馬焦蟲

圖4 驢焦蟲

圖5 豬附紅細(xì)胞體

圖6 羊附紅細(xì)胞體

圖7 豬胸腹水中弓形蟲（速殖子）

圖8 豬胸腹水中弓形蟲（包囊）

圖9 雞球蟲裂殖子（體）

圖10 雞球蟲卵