蜂蜜對創(chuàng)傷大鼠皮膚修復(fù)的作用及其機制的探討

(長江大學(xué)醫(yī)學(xué)部， 湖北 荊州 434023) (暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 廣東 廣州 510630)

眾所周知，皮膚傷后如果不能及時修復(fù)將會發(fā)生感染等問題，使傷口愈合更加困難，因此選擇具有促進傷口早期愈合的藥品或敷料是傷口治療和護理的關(guān)鍵。蜂蜜作為傷口敷料應(yīng)用于臨床以來，其功效顯而易見。據(jù)文獻[1～4]報道，在國內(nèi)外蜂蜜治療傷口的臨床研究中，所涉及的傷口呈多樣性，如感染性傷口、燒傷、混合性傷口、潰瘍、外傷、手術(shù)傷口、惡性傷口等，而且這些研究結(jié)果顯示蜂蜜可以有效治療傷口。由此可見，蜂蜜治療傷口的療效在臨床上已經(jīng)被驗證。在醫(yī)藥資源不豐富地區(qū)或者在環(huán)境條件受到限制的情況下，使用蜂蜜治療傷口不失為一種很好的選擇。然而，蜂蜜是如何促進傷口愈合的機理至今仍然不清楚，使蜂蜜的應(yīng)用受到局限。筆者以大鼠作為研究對象，在其背部皮膚建立傷口模型，用蜂蜜涂抹，并通過觀察蜂蜜在皮膚組織修復(fù)中炎性細胞浸潤、毛細血管再生、纖維組織形成等組織學(xué)指標的變化，揭示蜂蜜促進皮膚修復(fù)的演變過程和作用，從組織細胞學(xué)水平探討蜂蜜對創(chuàng)傷皮膚的修復(fù)機制。

1 材料與方法

1.1 材料來源

實驗用健康SPF級Wistar大鼠32只，由取得動物實驗資質(zhì)的動物實驗中心提供，雌雄各半，28d左右，體重約(95.0±4.0)g。蕎麥蜜(陜西老蜂農(nóng)蜂業(yè)有限公司)，皮膚取樣器(海德創(chuàng)業(yè)北京生物科技有限公司)，光學(xué)顯微鏡(上海光學(xué)儀器一廠)，無水乙醚(荊州市杰勝藥業(yè)有限公司)，蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1)建模方法。將大鼠用乙醚氣體吸入麻醉，剪去大鼠背部皮膚毛發(fā)2cm×2cm，兩指繃緊大鼠背部皮膚，用皮膚取樣器在剃毛區(qū)剃去皮膚，形成一個直徑為0.6cm的圓形創(chuàng)面，深度達筋膜，所有大鼠均在背部的相同位置建模。

2)分組方法。將32只建模大鼠隨機分為2組，即蜂蜜組和對照組，各16只。蜂蜜組：每天涂抹蜂蜜3次，每次涂抹蜂蜜0.5mL，每次涂抹蜂蜜后更換無菌敷料；對照組：不涂藥，僅用無菌紗布遮蔽，每次給蜂蜜組涂藥更換敷料的同時也為其更換紗布，使其自然愈合。

3)標本收集和處理。建模之后(不含當(dāng)天)的第1、3、5、7天，4d中每天每組隨機取4只大鼠切除包括傷口周圍1cm內(nèi)的正常皮膚直至筋膜，將其用組織固定液固定、常規(guī)脫水、浸蠟、石蠟包埋、連續(xù)切片(厚度為4μm)，并將切片脫蠟至水化，最后行HE染色。

4)觀察方法與指標。創(chuàng)面修復(fù)的觀察是通過光鏡完成，主要觀察指標為炎癥細胞浸潤、毛細血管再生和纖維組織增生等3項。評分標準：①無炎性細胞浸潤記0分，稀疏散在的浸潤記1分，密集的浸潤記2分，高度密集的浸潤記3分；②無新生毛細血管記0分，少量新生血管記1分，中量新生血管或者血管中含少許血細胞記2分，大量新生血管或者血管中含較多的血細胞記3分；③無成纖維細胞記0分，散在分布的成纖維細胞記1分，密集分布的成纖維細胞記2分，高度密集分布的成纖維細胞記3分。每只大鼠隨機選3張皮膚組織切片，每張切片取10個不重疊視野，分別在長軸中線4個和上下邊線各3個，共計4只鼠、3張片、10個視野，共計120個觀察點，進行觀察并記分。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 炎性細胞浸潤

表1 2組不同時間點炎性細胞浸潤的積分比較

傷后第1天2組均出現(xiàn)不同程度的炎性細胞浸潤，細胞間質(zhì)疏松水腫，尤其是蜂蜜組較對照組更為明顯，大多數(shù)觀察點有大量密集的炎性細胞浸潤，2組得分有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；第3天蜂蜜組浸潤較第1天明顯減少，而對照組反而加重，可見大量中性粒細胞、淋巴細胞等炎性細胞聚集成團，2組得分有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；第5天蜂蜜組少數(shù)觀察點有少許炎性細胞，對照組浸潤與第3天比較減少并不顯著，2組得分有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；第7天蜂蜜組未見炎性細胞，對照組浸潤與第5天有下降，但仍然清晰可見，2組得分有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，見表1。對照組第1、3、5、7天炎性細胞浸潤如圖1所示；蜂蜜組第1、3、5、7天炎性細胞浸潤如圖2所示。

2.2 毛細血管增生

第1天2組均未見新生毛細血管；第3天蜂蜜組出現(xiàn)中等量新生毛細血管，對照組有少量的新生毛細血管，2組比較有顯著差異(P<0.05)；第5天蜂蜜組毛細血管增生更加明顯，大量新生毛細血管呈擴張狀態(tài)，內(nèi)含血液。對照組毛細血管增生與第3天比較不明顯，2組有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；第7天蜂蜜組新生毛細血管的程度較第5天明顯下降，大部分觀察點只有少量新生毛細血管。相反對照組毛細血管增生繼續(xù)保持升高態(tài)勢，2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。對照組第1、3、5、7天毛細血管增生如圖1所示；蜂蜜組第1、3、5、7天毛細血管增生如圖2所示。

圖1 對照組炎性細胞浸潤、毛細血管增生和纖維增生(HE,×20) 圖2 蜂蜜組炎性細胞浸潤、毛細血管增生和纖維增生(HE,×20)

組別毛細血管增生積分/分第1天第3天第5天第7天對照組01.08±0.6681.58±0.7932.42±0.516蜂蜜組01.75±0.4522.66±0.6510.83±0.717t-3.3934.6618.227P-0.0060.0000.000

表3 2組不同時間點纖維增生的積分比較

2.3 纖維增生

2組第1天均未見成纖維細胞；第3天蜂蜜組可見中等量梭形成纖維細胞，對照組有少量成纖維細胞，2組有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；第5天蜂蜜組有大量密集的成纖維細胞，排列規(guī)則，呈束狀分布。對照組成纖維細胞較第3天有少量增加，但未達到中等量，2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；第7天蜂蜜組成纖維細胞數(shù)量很少見，較第5天顯著減少，間質(zhì)明顯增多。對照組成纖維細胞繼續(xù)明顯增加，2組有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，見表3。對照組第1、3、5、7天纖維增生如圖1所示；蜂蜜組第1、3、5、7天纖維增生如圖2所示。

3 討論

3.1 皮膚組織修復(fù)機制

創(chuàng)傷愈合是皮膚組織修復(fù)的過程，當(dāng)皮膚受傷時，皮膚組織即刻發(fā)生包括炎性反應(yīng)、以血管內(nèi)皮細胞和成纖維細胞為主的各種細胞再生、肉芽組織填充和瘢痕形成等在內(nèi)的一系列復(fù)雜的組合變化，表現(xiàn)出各種修復(fù)的協(xié)同作用。由于皮膚是由表皮、真皮、皮下組織等部分構(gòu)成，因此受傷的深度不同其修復(fù)的機理也不一樣[5]。筆者給大鼠皮膚造模的創(chuàng)傷深度達筋膜，屬于全層皮膚傷。根據(jù)皮膚全層受傷的組織修復(fù)機制分析：當(dāng)大鼠皮膚創(chuàng)傷造模成功時，首先出現(xiàn)局部的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為毛細血管通透性增加，各種炎癥細胞向創(chuàng)傷處聚集，如單核-巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞和肥大細胞等[6]，它們不僅具有強大的吞噬能力，吞噬創(chuàng)傷局部的細菌和異物顆粒，達到清理局部和抗菌的目的[7]；還可以相互作用和轉(zhuǎn)化，來調(diào)控傷口愈合[8]。緊接著鄰近創(chuàng)面的血管其內(nèi)皮細胞通過分裂增生向無血管或者少血管區(qū)遷移，逐漸形成毛細血管芽，這些毛細血管芽再通過延伸融合成網(wǎng)，進而管道化且有血液進入。在不給予干預(yù)的情況下大約在傷后第3天即可見毛細血管芽從傷口邊緣長出[9]。在新生毛細血管生長的同時，鄰近的成纖維細胞也同時增生，與新生毛細血管共同構(gòu)成肉芽組織，向創(chuàng)面移行填塞傷口，并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，不斷分裂、增殖，分泌膠原，形成纖維組織。同時成纖維細胞還可分泌成纖維細胞生長因子，促進創(chuàng)緣表皮細胞增生，逐漸覆蓋傷口[10]，使傷口愈合。在此期間，倘若炎性細胞的吞噬能力不足以清除細菌創(chuàng)面就會繼發(fā)感染；倘若肉芽組織增生過度還會形成病理性瘢痕。據(jù)文獻報道，創(chuàng)面愈合時間越長，產(chǎn)生病理性瘢痕的機率則越大[11]。因此及早使創(chuàng)面愈合既可以減少繼發(fā)感染的機會，也可以有效減少增生性瘢痕產(chǎn)生的可能性。顯然以上創(chuàng)面愈合的自然過程，需要有良好的環(huán)境條件做保障?？梢姞I造良好的傷口愈合環(huán)境、縮短傷口愈合時間、阻止肉芽組織過度增生是促進傷口安全愈合的關(guān)鍵。

3.2 蜂蜜在創(chuàng)面愈合中的作用

蜂蜜有其特殊的理化性質(zhì)，可以為傷口愈合提供良好條件。首先它含有70%～80%的糖分[12]，能營造一種高滲環(huán)境，這種高滲環(huán)境不僅可以吸收深層體液來保持創(chuàng)面濕潤、吸收炎性細胞內(nèi)水分來消除創(chuàng)面水腫，從而保護創(chuàng)面；還可以使細菌脫水死亡，達到抑制細菌生長的目的[13]，這也是為什么有文獻報道[1]蜂蜜對感染性傷口具有良好療效的原因。其次，蜂蜜中還含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如葡萄糖、轉(zhuǎn)化糖、轉(zhuǎn)化酶及多種維生素、微量元素、氨基酸等[14]，這些營養(yǎng)物質(zhì)一旦被組織細胞利用，則有利于加速創(chuàng)面愈合。

研究結(jié)果顯示，對照組因為沒有給予干預(yù)措施，其創(chuàng)傷愈合過程符合上述的傷口自然愈合規(guī)律；而蜂蜜組則可以加速傷口愈合，防止瘢痕形成。

從炎性浸潤看，對照組呈現(xiàn)出第1天大量浸潤、第3天浸潤更加嚴重、第5天持續(xù)高水平狀態(tài)、第7天才逐漸下降的變化過程。而蜂蜜組在傷后第1天炎性細胞浸潤即達頂峰，之后保持迅速下降趨勢，第7天炎性細胞完全消失。這充分說明蜂蜜在皮膚受傷早期可以促進皮膚組織炎性細胞的快速分泌，從而加強清理局部異物和抵抗細菌的功效，預(yù)防創(chuàng)面繼發(fā)感染；中期則可抑制炎性細胞分泌，是具有促炎和抗炎雙重作用的物質(zhì)。蜂蜜之所以具有雙重作用是因為：蜂蜜中不僅含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，還含有大量的生物活性物質(zhì)，如黃酮類、酚酸類、有機酸、芳香物質(zhì)等[15]，這些生物活性物質(zhì)具有免疫調(diào)節(jié)作用，在皮膚受傷早期可以通過增強細胞內(nèi)線粒體的活性來活化巨噬細胞、淋巴細胞等炎性細胞[16]，使其快速增殖，大量分泌；在創(chuàng)傷愈合的中期通過抑制機體多種免疫刺激性細胞因子的釋放[17]，使炎性細胞的增殖得到控制，從而抑制皮膚組織的炎性反應(yīng)。不僅如此，蜂蜜還可以通過營造一種高滲環(huán)境，消除創(chuàng)面的炎性水腫，促進炎癥消散，為創(chuàng)面早期愈合奠定基礎(chǔ)。鑒于上述分析，筆者認為蜂蜜的這種抵抗細菌的較強能力和抑制炎性反應(yīng)的強大作用很可能就是它促進傷口愈合的重要原因之一。

從新生毛細血管和纖維組織增生看，對照組在傷后的第3天開始有少量的新生毛細血管和成纖維細胞出現(xiàn)，之后逐漸增加，直至第7天還大量存在，仍然保持高水平狀態(tài)，這就給肉芽組織的繼續(xù)形成創(chuàng)造了條件。由于此時正處于創(chuàng)傷愈合后期，如果肉芽組織繼續(xù)不斷形成，產(chǎn)生瘢痕的可能性則增大。產(chǎn)生這一結(jié)果的原因可能有2個：一是此時傷口還沒有完全愈合，仍然需要肉芽組織去繼續(xù)填充；二是此時創(chuàng)傷局部的炎性細胞水平仍然較高，這些炎性細胞可以產(chǎn)生大量的生物活性因子，如轉(zhuǎn)化生長因子、成纖維生長因子、血小板源生長因子等[16]，而這些生物活性因子可以促進毛細血管再生和成纖維細胞形成[18]，致使新生毛細血管和纖維組織水平不會降低。蜂蜜組在傷后的第3天不僅可以見到新生的毛細血管和成纖維細胞，而且其增生異?；钴S，增生的速度和量遠超對照組。這種高水平的增生維持到第5天達到高峰，然后快速下降，第7天僅剩少量新生毛細血管和成纖維細胞。這充分說明蜂蜜在創(chuàng)面愈合的中期可以加速毛細血管和纖維組織增生，致使毛細血管和纖維增生的峰值提前，加快創(chuàng)面愈合；在創(chuàng)面愈合的后期蜂蜜能迅速限制毛細血管和纖維組織增生，阻止其增生過度而形成病理性瘢痕。分析其原因，這可能與蜂蜜具有免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。據(jù)文獻報道，在創(chuàng)傷早期蜂蜜能夠介導(dǎo)成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、血小板源生長因子和腫瘤壞死因子等各種因子的釋放[19]，這些生長因子和細胞因子可以刺激血管內(nèi)皮細胞和成纖維細胞快速生長[20]，從而促進血管新生和纖維組織增生。也正是因為蜂蜜可以使創(chuàng)面局部的毛細血管增生活躍，創(chuàng)面微循環(huán)豐富，蜂蜜中豐富的營養(yǎng)物質(zhì)就很容易被組織細胞獲取，為毛細血管和纖維組織的生長提供營養(yǎng)，進一步加速毛細血管和纖維組織的生長，因此蜂蜜組與對照組比較，毛細血管和纖維組織生長峰值明顯提前，創(chuàng)面愈合的速度加快。筆者認為這也是蜂蜜能促進創(chuàng)面修復(fù)的重要原因。在創(chuàng)傷修復(fù)的后期，蜂蜜可以刺激機體產(chǎn)生較多的某種具有停止信號功能的物質(zhì)，從而減小毛細血管再生和纖維組織增生的作用[17]，使毛細血管和纖維組織的增生減少甚至停止。當(dāng)然這一推理還需要做更多的研究給予驗證。由此可見，蜂蜜一方面是通過促進皮膚創(chuàng)面早期愈合來預(yù)防瘢痕的形成，另一方面是通過限制毛細血管和纖維組織的增生達到預(yù)防瘢痕形成的目的。

綜上所述，蜂蜜在皮膚組織修復(fù)中對炎性浸潤、毛細血管再生、纖維組織增生的影響具有雙重性。在皮膚修復(fù)的早期(1～2d)，蜂蜜可以促進炎性細胞的大量分泌，既可以提高局部的抗菌能力，避免創(chuàng)面繼發(fā)感染，又可以充分發(fā)揮炎性細胞的調(diào)節(jié)作用；在皮膚修復(fù)的中期(3～5d)，蜂蜜具有抗炎性細胞分泌，促進炎癥消散，為創(chuàng)面愈合營造良好環(huán)境的作用，具有促進毛細血管再生和纖維組織增生，加速肉芽組織形成，加快創(chuàng)面愈合的作用；在皮膚修復(fù)的后期(6～7d)，蜂蜜可以抑制毛細血管再生和纖維組織增生，阻止肉芽組織生長，預(yù)防瘢痕形成。筆者研究只是從組織細胞學(xué)水平探討了蜂蜜在皮膚修復(fù)中的作用，仍然還需要進一步從分子學(xué)角度探討蜂蜜在皮膚組織修復(fù)中的調(diào)控機制。