2017—2018年江西地區(qū)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的分子流行特征

曾 凌，鄧 瓊，劉 洋，張 杰，曾 婷，曹先偉

(1. 南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)院感染管理科，江西 南昌 330006； 2. 南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006； 3. 南昌大學(xué)江西醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330006)

耐藥菌的出現(xiàn)與流行已成為全球一個(gè)不容忽視的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題，越來越多的病原菌對常用抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，且耐藥水平不斷上升。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)臨床分離率高，耐藥譜廣，可造成區(qū)域性暴發(fā)流行，治療非常困難，導(dǎo)致患者住院時(shí)間明顯延長，醫(yī)藥費(fèi)用大幅度增加，病死率增高[1-2]。殺白細(xì)胞素(Panton-Valentine leukocidin,PVL)是壞死性細(xì)胞毒素，具有廣泛的溶胞作用，除可促進(jìn)膿腫形成外，還可引起嚴(yán)重甚至致命性肺炎[3]。不同地區(qū)的 MRSA 流行株呈現(xiàn)規(guī)律性分布，主要流行克隆株有一定的地區(qū)差異，且可隨時(shí)間發(fā)生變遷，對當(dāng)?shù)胤蛛x菌株進(jìn)行分子分型，了解菌株間的親緣關(guān)系，明確當(dāng)?shù)亓餍锌寺?，對臨床合理診治感染，以及減少和控制耐藥細(xì)菌的傳播有重要意義。本研究采用分子分型技術(shù)，研究江西省MRSA的分子流行病學(xué)特點(diǎn)，揭示MRSA的遺傳進(jìn)化規(guī)律，并對PVL毒力基因進(jìn)行檢測，比較不同克隆間毒力因子的差異，探討流行克隆可能的競爭優(yōu)勢，并為后續(xù)的機(jī)制研究提供資料。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2017年1月—2018年12月江西省11個(gè)城市11所醫(yī)院臨床MRSA菌株。所有標(biāo)本均為無菌體液(血、尿、關(guān)節(jié)液、腦脊液、封閉的腹腔積液等)、高質(zhì)量呼吸道標(biāo)本(深部痰、支氣管灌洗液等)，以及傷口分泌物等。為更好的體現(xiàn)MRSA感染的流行病學(xué)特征，僅納入同一患者首次分離的菌株。所有菌株除采取常規(guī)手工鑒定以及全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)VITEK 2 Compact進(jìn)行鑒定外,同時(shí)經(jīng)mecA+femB 雙重 PCR 法雙陽性者確認(rèn)為 MRSA。

1.2 主要儀器與試劑 PCR儀(Bio-Rad)，VITEK濁度儀(BioMerieux)，脈沖場凝膠電泳儀(Bio-Rad)，EDTA(北京鼎國)，蛋白酶K(上海生工)，溶葡萄球菌酶(上海生工)，Sma I 限制性內(nèi)切酶(Takara)，瓊脂糖(Biowest)，Ex Taq DNA 聚合酶(Takara)。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 spa分型、SCCmec分型、多位點(diǎn)序列分型(MLST)及PVL基因所使用的引物參照文獻(xiàn)[4-5]設(shè)計(jì)，引物合成及擴(kuò)增產(chǎn)物測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.4 方法

1.4.1 藥敏試驗(yàn) 鑒定儀為法國VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏儀，釆用微量稀釋法做體外藥物敏感性試驗(yàn)，參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(M100-S27)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)和EUCAST標(biāo)準(zhǔn)判斷藥物的敏感性。金黃色葡萄球菌ATCC 25923作為質(zhì)控菌株。

1.4.2 spa分型 spa分型主要是基于spa基因X區(qū)重復(fù)序列的多態(tài)性,參照文獻(xiàn)[6]，采用PCR方法擴(kuò)增spa目標(biāo)序列并測序，截取重復(fù)序列區(qū)域，登錄官方網(wǎng)站(http://www.ridom.de/spaserver/)，得到該菌株的 spa 型別。

1.4.3 SCCmec分型 采用多重PCR方法[7]擴(kuò)增SCCmec目標(biāo)序列，在紫外凝膠成像儀下觀察是否出現(xiàn)目的條帶，依據(jù)條帶位置確定分型。

1.4.4 脈沖場凝膠電泳(PFGE)分型和多位點(diǎn)序列分型(MLST) 綜合應(yīng)用PFGE和MLST對菌株進(jìn)行同源性分析。 用SmaI(Bio-Rad Laboratories，CA，USA)消化整個(gè)染色體DNA，并在CHEF Mapper XA System中分離限制性片段。通過Dice相似系數(shù)和未加權(quán)配對組匹配算法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析，MLST是以7個(gè)管家基因(arcc、gmk、aroe、glp、pta、tpi、ygil)為基礎(chǔ)進(jìn)行型別分析。參照文獻(xiàn)[8]，采用PCR方法擴(kuò)增MLST的7對目標(biāo)序列并測序，確認(rèn)測序結(jié)果質(zhì)量后將得到的結(jié)果序列提交至官方網(wǎng)站(http://www.mlst.net/)，確定每一株菌的等位基因譜，并得到該菌株的MLST型別。

1.5 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用WHONET 5.6對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 MRSA來源與分布 2017年1月—2018年12月江西省11所醫(yī)院共收集臨床分離MRSA 250株，經(jīng)mecA+femB雙重PCR擴(kuò)增和綜合藥敏結(jié)果確認(rèn)后，納入本研究的MRSA 237株，其中，南昌32株，九江25株，景德鎮(zhèn)19株，上饒40株，鷹潭27株，撫州21株，新余6株，宜春10株，萍鄉(xiāng)17株，吉安20株，贛州20株。標(biāo)本類型中，主要為分泌物，占31.22%(74株)，痰占29.11%(69株)，血占16.46%(39株)。見圖1。

圖1 江西省MRSA地區(qū)及標(biāo)本來源分布

2.2 spa分型結(jié)果 對237株MRSA進(jìn)行spa分型，共分為40個(gè)型別，發(fā)現(xiàn)新的spa基因型3株。其中主要型別為t437(74株，占31.22%)、t030(32株，占13.50%)、t114(20株，占8.44%)、t172(15株，占6.33%)、t441(14株，占5.91%)、t062(11株，占4.64%)。不同地區(qū)MRSA分離株的spa型別存在差異，除南昌地區(qū)以t030為主，其余地區(qū)均以t437為主，其他spa型別散在分布于各地區(qū)。

2.3 SCCmec基因分型結(jié)果 對237株MRSA分離株進(jìn)行SCCmec基因分型，結(jié)果表明 SCCmecIVa為優(yōu)勢型別共158株，占66.67%；SCCmecⅢ共35株，占14.77%；SCCmecⅡ共32株，占13.50%；SCCmecⅴ共8株，占3.38%；未分型菌株4株。從各地區(qū)分布來看，南昌地區(qū)以SCCmecⅢ為主要型別，占59.38%(19/32)；其余各地區(qū)均以SCCmecIVa為主要優(yōu)勢型別。

2.4 PFGE分型和MLST結(jié)果 對237株MRSA進(jìn)行PFGE分型，經(jīng)聚類分析，結(jié)果為A～V 21個(gè)聚類組，從每一聚類組中抽取代表菌株進(jìn)行MLST分析，優(yōu)勢型別為ST239、ST59、ST1和ST338克隆，分別占44.30%(105株)、32.07%(76株)、4.64%(11株)和2.53%(6株)，其他克隆型別散在分布，同時(shí)發(fā)現(xiàn)3株新的ST克隆型別。

通過eBURST軟件聚類分析，21種不同型別的克隆分為9個(gè)克隆群(clonal complex,CC)。ST239屬于CC239克隆群，是最優(yōu)勢的克隆群，占44.30%(105株)；ST59屬于CC59克隆群，同時(shí)還包括ST1778、ST2207、ST338、ST545、ST925、ST3191克隆型，占42.19%(100株)；ST1屬于CC1克隆群，同時(shí)還包括ST726和ST2125，占6.33%(15株)；ST4和ST45型同屬于CC4克隆型，占1.69%(4株)；其余ST7、ST5、ST409、ST70、ST1232分別屬于不同克隆群。見圖2。

圖2 21種ST型別的聚類分析(eBURST)

2.5 PVL毒力因子檢測結(jié)果 237株MRSA中，檢出PVL 32株,檢出率為13.50%。地區(qū)分布顯示，鷹潭地區(qū)PVL檢出率最高，為29.63%，其次景德鎮(zhèn)地區(qū)為26.32%，吉安地區(qū)為25.00%。分子分型顯示，PVL陽性菌株中spa型別主要為t437型，占59.38%(19/32)，且19株t437型菌株SCCmec分型均為IVa，其中16株為ST59，江西地區(qū)PVL陽性菌株的主要型別為ST59-MRSA-IVa-t437型，見表1、2。

2.6 MRSA 分子特征 各種分型方法綜合分析顯示，ST59-MRSA-IVa-t437為江西地區(qū)的主要優(yōu)勢流行克隆型，且各地區(qū)之間存在一定程度的克隆播散。ST239-MRSA-Ⅲ-t030為次要優(yōu)勢流行克隆型，主要在南昌地區(qū)多見，其他地區(qū)散發(fā)，詳見表3。

3 討論

研究[9-10]表明，MRSA醫(yī)院感染主要是由少數(shù)流行菌株引起，這些菌株一旦在醫(yī)院定植，即可造成醫(yī)院或地區(qū)，甚至不同國家之間的暴發(fā)流行?？刂屏餍械闹匾呗栽谟诿鞔_流行環(huán)節(jié)，切斷傳播途徑，終止耐藥菌株在人群中的傳播。因而，掌握分子特征對于鑒別菌株間的親緣性，有效控制感染意義重大。為鑒別流行菌株，追蹤傳染源，國內(nèi)外廣泛采用的方法是對臨床分離菌株進(jìn)行分型研究，以確定菌株之間的同源性，從而為制定感染控制策略提供依據(jù)。

表1 各地區(qū)PVL毒力因子陽性情況

表2 32株P(guān)VL毒力基因陽性株各分型分布(株)

spa分型以spa基因的高變區(qū)X區(qū)為目標(biāo)基因，具有分辨率高、分型能力強(qiáng)、檢測速度快、結(jié)果命名標(biāo)準(zhǔn)化的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果可相互比較，但對于極少數(shù)菌株分型可能有誤差。SCCmec分型針對可移動(dòng)元件分型，結(jié)果有國際標(biāo)準(zhǔn)，不同實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果可進(jìn)行比較。SCCmec分型的主要方法是多重PCR法或?qū)崟r(shí)熒光定量PCR法，其中多重PCR因?yàn)闊o需特殊設(shè)備和相對較低的成本，應(yīng)用更廣，且對常見的SCCmec分型有較好的效果[10]。PFGE分型可較準(zhǔn)確地分辨某地區(qū)某時(shí)期內(nèi)流行菌株間同源性關(guān)系及各醫(yī)院間相互傳播情況，但不適用于長時(shí)間的全球流行病學(xué)監(jiān)測。而MLST的應(yīng)用很好地解決了此問題，其以7個(gè)管家基因(arcc、aroe、glp、gmk、pta、tpi、yqil)為基礎(chǔ)，結(jié)果定義國際化，可相互比較，適用于宏觀進(jìn)化的研究，但此方法價(jià)格昂貴，分型能力稍低。此外，對特殊菌株可采取全基因組測序分型，進(jìn)行全基因組比較，但此方法價(jià)格昂貴，技術(shù)要求高，分析比較復(fù)雜[11]。

表3 237株MRSA主要分子分型結(jié)果(株)

注：除CC239、CC59、CC1、CC4幾個(gè)主要的克隆群外，其余ST7、ST5、ST409、ST70、ST1232分別屬于不同克隆群。僅列出MRSA 的主要分子分型結(jié)果，一些散在的分型未列出

目前，全球MRSA主要流行克隆型包括ST239-Ⅲ型(巴西/匈牙利克隆)、ST247-IA(伊伯利亞克隆)、ST45-IV(柏林克隆)等[12-14]，亞洲地區(qū)MRSA流行趨勢與其他地區(qū)不同，不同國家和地區(qū)之間差異也很大。如ST45-MRSA-IV克隆，也稱為柏林流行株，常引起血流感染或呼吸道疾病病例暴發(fā)，而在中國大陸卻少見報(bào)道。ST59-MRSA-IVa-t437為江西地區(qū)主要優(yōu)勢流行克隆型，且各地區(qū)之間存在一定程度的克隆播散。ST239-MRSA-Ⅲ-t030為次要優(yōu)勢流行克隆型，主要在南昌地區(qū)多見，其他地區(qū)散發(fā)，該結(jié)果與熊祝嘉等[9]對全國6個(gè)地區(qū)7所醫(yī)院114株樣本的分型結(jié)果基本相符。spa是金黃色葡萄球菌的重要毒力因子，能幫助細(xì)菌逃避宿主的免疫反應(yīng)。2009發(fā)現(xiàn)spa-t030克隆成為優(yōu)勢克隆型別后，相關(guān)研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)ST239-MRSA-III-t030具特定耐藥譜，且其生存能力更強(qiáng)[15]。但仍需要警惕ST59的克隆播散，ST59-t437克隆型別的MRSA比ST239-t030-MRSA更易導(dǎo)致基因結(jié)構(gòu)的變化，降低藥物敏感性[16]。同時(shí)ST59菌株在美國、新加坡、中國臺灣地區(qū)及香港地區(qū)的CA-MRSA中廣泛傳播[17]。ST59-MRSA在中國的南方兒科患者中也普遍存在[18]，江西地區(qū)的流行克隆株，可能是中國香港、臺灣地區(qū)傳播至中國內(nèi)陸地區(qū)所致[19]。而ST59一直被認(rèn)為是中國地區(qū)CA-MRSA最常見克隆，加拿大的一項(xiàng)研究[20]顯示，醫(yī)院感染從2007—2011年短短5年CA-MRSA的比例翻了一倍。深圳市9所醫(yī)院研究[7]顯示，28.9%的HA-MRSA菌株是CC59-MRSA-IV/V-t437克隆，是典型的CA-MRSA的特征。亞洲各國面臨同樣處境，研究[14,20]顯示，ST59-MRSA-IV-t437克隆在中國臺灣地區(qū)以及韓國的醫(yī)院均有報(bào)道。

不同國家、地區(qū)MRSA SCCmec優(yōu)勢型別也存在明顯差異。亞洲地區(qū)，日本和韓國以SCCmec Ⅱ型為優(yōu)勢型別，我國香港和臺灣地區(qū)均以SCCmec Ⅲ型為優(yōu)勢型別[21]。本研究結(jié)果表明，江西地區(qū)以SCCmecIVa為優(yōu)勢型別，占66.67%；SCCmecⅢ和SCCmecⅡ分別占15.19%、13.50%；從各地區(qū)分布來看，除南昌地區(qū)以SCCmec Ⅲ為主要型別外(占59.38%)，其余各地區(qū)都是以SCCmecIVa為主要優(yōu)勢型別。SCCmec Ⅲ型以HA-MRSA為主，SCCmecIVa以CA-MRSA為主，考慮南昌地區(qū)醫(yī)院為省級醫(yī)院，收治的患者多為各地區(qū)的重癥患者，更易發(fā)生醫(yī)院感染，而下級醫(yī)院收治患者病情較輕，感染更多來自社區(qū)。CA-MRSA菌株中由于SCCmec元件相對較小，其負(fù)載的耐藥基因較少，更有利于傳播，造成大范圍的流行。另外本研究未見 SCCmec I 型菌株，近年來也尚未見到相關(guān)研究報(bào)道，推測可能I型菌株為最早的流行菌株，流行時(shí)間長，已被Ⅱ、Ⅲ型菌株取代[22]。

本研究237株MRSA PVL陽性率為13.50%。研究[23]顯示，攜帶PVL毒素的致病性金黃色葡萄球菌與皮膚及軟組織感染、壞死性肺炎、壞死性筋膜炎等嚴(yán)重壞死性疾病密切相關(guān)，且致死率較高。2000年以前，未發(fā)現(xiàn)HA-MRSA中攜帶PVL，PVL曾被認(rèn)為是CA-MRSA的特有生物學(xué)標(biāo)記[24]。但近年研究發(fā)現(xiàn)，HA-MRSA中也可檢出PVL基因，而CA-MRSA菌株也可不攜帶PVL基因[24-25]。本研究中PVL陽性株無明顯CA-MRSA或HA-MRSA偏向，表明PVL并非是CA-MRSA的特有生物學(xué)標(biāo)記，在HA-MRSA中PVL檢出越來越常見，有產(chǎn)生高耐藥、高毒力菌株的趨勢，值得關(guān)注。從城市分布來看，鷹潭地區(qū)PVL陽性率最高，景德鎮(zhèn)地區(qū)檢出率次之，吉安地區(qū)檢出率第三，呈現(xiàn)由東部向四周降低的趨勢。因此，要加強(qiáng)對東部地區(qū)MRSA PVL陽性菌株的研究。

由此可見，不同型別的MRSA耐藥情況和耐藥機(jī)制并不完全一致，更加突出了對MRSA進(jìn)行分子學(xué)分型的重要性，臨床醫(yī)生在選擇抗菌藥物時(shí)應(yīng)注意不同型別菌株的耐藥情況，在耐藥率逐漸升高的情況下，有效控制患者病情顯得尤為重要。本研究中，雖然選取了11個(gè)地級市11所三甲醫(yī)院，盡量保證菌株的代表性與可比性，MRSA克隆分布的不均一性仍然存在一些不可控性，一方面可能與獨(dú)特的地理位置密切相關(guān)；另一方面，不同城市的經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平與醫(yī)療資源的配置也不同，而且流動(dòng)人口也可能導(dǎo)致MRSA的克隆分布不均一。