超聲輔助醇提商洛金銀花黃酮工藝優(yōu)化研究

何 軍

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

金銀花，又名忍冬(FlosLonicerajaponica)，忍冬科忍冬屬多年生半常綠纏繞及匍匐莖的灌木，我國常用大宗中藥材[1-2]。從其植株中分離出有機(jī)酸[3]、黃酮[4]、揮發(fā)油[5]、多糖[6]等200多種化學(xué)成分[7]，除綠原酸之外，黃酮類化合物也是其主要有效成分之一，具有顯著的抗氧化作用[8-12]，在臨床上有保肝利膽、抗腫瘤、降血糖血脂的功效[13-14]，因此黃酮含量的高低也是評(píng)判金銀花質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)之一[15]。

金銀花在商洛山區(qū)的分布十分廣泛，種植面積逐年擴(kuò)大，自2008年以來，以商州、鎮(zhèn)安、柞水、山陽、丹鳳為中心，在南北山區(qū)的800～1200 m區(qū)域的山坡地帶集中建立了金銀花基地13333.3 hm2，其中建立野生撫育基地6666.7 hm2。金銀花在商洛的收購量占到全省總收購量的50%以上[16]，是陜西省金銀花的第一主產(chǎn)區(qū)，它包括金銀花在內(nèi)的“商藥”品牌正在成為商洛的一張名片，正在扮靚商洛中藥產(chǎn)業(yè)，并輻射帶動(dòng)整個(gè)陜南地區(qū)及毗鄰省區(qū)中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

目前，金銀花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展仍然以種植業(yè)為主，產(chǎn)品加工處于初級(jí)形態(tài)，工業(yè)規(guī)模小，加工工藝落后，商業(yè)也很薄弱，整個(gè)產(chǎn)業(yè)頭重腳輕，發(fā)展極不平衡，嚴(yán)重制約了當(dāng)?shù)刂兴幃a(chǎn)業(yè)的發(fā)展。鑒于此，本文以商洛市金銀花為材料，在傳統(tǒng)醇提取法的基礎(chǔ)上，采用超聲輔助處理，提取其有效成分，探索出一條既經(jīng)濟(jì)、高效，又適合商洛當(dāng)?shù)厣a(chǎn)的提取工藝，以期為商洛當(dāng)?shù)亟疸y花資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

金銀花(購于商洛市洛南縣麻坪鎮(zhèn)陳臺(tái)村8組)，將其放于60 ℃恒溫干燥箱進(jìn)行烘干，除雜，粉碎，過60目國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩，之后各用密封袋包裝并置于干燥器內(nèi)備用。

1.2 試驗(yàn)試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品HPLC≥99%(成都埃法生物有限公司)，NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、無水乙醇，均為分析純。所用水均為去離子水。

1.3 儀器設(shè)備

多功能中草藥粉碎機(jī)(750T)，低溫高速離心機(jī)(TDL-5A)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(101型)，電子精密天平(FA1104)，超聲波處理器(KQ5200E)，紫外可見分光光度計(jì)(UV-1780)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 提取工藝 傳統(tǒng)方法有水提法[17]、醇提法等[18-19]，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了許多新型提取方法，如微波輔助提取法[20-21]、超聲波法[22]、超臨界流體萃取技術(shù)等[23-25]。

在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)采用超聲波法輔助提取的工藝，其流程為：金銀花→干燥→粉碎→超聲輔助提取→離心(4000 r/min)20 min→取一定量上清液→稀釋一定倍數(shù)→亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法→測定。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密儀器準(zhǔn)確稱取經(jīng)充分干燥的蘆丁粉末5.0 mg，用75%乙醇溫水浴中溶解后，移至25 mL容量瓶中定容至刻度，即為0.2 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液搖勻備用。準(zhǔn)確量取0.2 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL置于25 mL的容量瓶中，各加入1 mL的5% NaNO2溶液混勻，6 min后各加入1 mL的10% Al(NO3)3混勻放置6 min，再加入10 mL的4.3% NaOH溶液，75%乙醇定容搖勻，放置15 min，以空白液為對(duì)照，在510 nm波長下測定各濃度標(biāo)樣的吸光度。以吸光度A作為縱坐標(biāo)，以總黃酮的濃度C作為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3 黃酮含量測定方法 本試驗(yàn)參照汪秀妹[26]采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定金銀花總黃酮含量。將試樣液稀釋10倍，移取6 mL于25 mL容量瓶中，按照其2.2.1章節(jié)所敘述的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的方法測定其吸光值，通過回歸方程計(jì)算各樣品中黃酮的含量。再按下式計(jì)算總黃酮的提取率。

X=(C×V×F)/(m×1000000)

式中：X為樣品中黃酮類化合物含量(%)，C為依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出被測液中黃酮濃度(μg/mL)，m為樣品的質(zhì)量(g)，F(xiàn)為稀釋倍數(shù)，V為待測液的總體積(mL)。

1.4.4 單因素試驗(yàn) 本試驗(yàn)采用超聲波輔助乙醇法提取金銀花總黃酮，在參照文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，研究發(fā)現(xiàn)，影響金銀花得率的因素有超聲功率、超聲提取溫度、超聲提取時(shí)間等，本研究選擇了超聲提取溫度、乙醇濃度、料液比、超聲提取時(shí)間作為主要影響因子，研究它們對(duì)金銀花總黃酮得率的影響。單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：

超聲溫度：35、45、55、65、75 ℃；乙醇濃度：25%、40%、55%、70%、85%；料液比(m/v,g/mL)：1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50；超聲時(shí)間：30、40、50、60、70 min。

1.4.5 正交試驗(yàn)研究 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在每個(gè)因素里面選擇對(duì)金銀花中總黃酮提取率影響較大的3個(gè)水平，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，以商洛金銀花總黃酮的提取率為檢測指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)試驗(yàn)測定結(jié)果，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=11.546x-0.0845 (R2=0.9996)，其中y值為吸光度(Abs)，x值為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(mg/mL)。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素研究

2.2.1 不同超聲提取溫度對(duì)金銀花總黃酮提取的影響 精確稱量金銀花樣品5.0 g，選取超聲溫度為35、45、55、65、75 ℃，乙醇濃度55%，料液比1∶20，超聲浸提時(shí)間為30 min。超聲溫度對(duì)黃酮提取率的影響結(jié)果見圖2。

圖2 不同超聲提取溫度對(duì)金銀花總黃酮提取的影響

由圖2可知，總黃酮提取率最高為1.81%，黃酮類化合物是一種天然的抗氧化劑，所以它本身容易在高溫下氧化。當(dāng)溫度在45～65 ℃時(shí)，得到的黃酮提取率為最高。一旦超過55 ℃，黃酮的提取率就會(huì)下降，這可能是因?yàn)樵诟邷叵虏糠贮S酮被氧化了。故選超聲溫度45、55、65 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn)分析。

2.2.2 不同乙醇濃度對(duì)金銀花總黃酮提取的影響 精確稱量金銀花樣品5.0 g，選取乙醇濃度25%、40%、55%、70%、85%，以1∶20的料液比，在55 ℃下超聲浸提30 min。乙醇濃度對(duì)金銀花總黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 不同乙醇濃度對(duì)金銀花總黃酮提取的影響

由圖3可知,隨著乙醇濃度的增加，黃酮的提取率也相應(yīng)提高，得到的最大值為1.39%，但乙醇濃度超過55%后，黃酮的提取率反而降低。這可能是因?yàn)槟承S酮類物質(zhì)的溶出被高濃度的乙醇限制了。故選乙醇濃度40%、55%、70%、進(jìn)行正交試驗(yàn)分析。

2.2.3 不同料液比對(duì)金銀花總黃酮提取的影響 精確稱量金銀花粉末5.0 g，選取料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，乙醇濃度55%，在55 ℃下超聲浸提30 min。料液比對(duì)金銀花總黃酮提取率的影響見圖4。

以乙醇為溶劑提取時(shí)，適當(dāng)加大料液比，可將更多的被提取物質(zhì)提取出來。由圖4可知，用乙醇提取金銀花中總黃酮時(shí)，黃酮提取率會(huì)隨著隨著料液比的加大而加大，但當(dāng)料液比超過1∶30時(shí)，黃酮的提取率增加不大，金銀花黃酮最大提取率為1.72%。故選料液比1∶20、1∶30、1∶40進(jìn)行正交試驗(yàn)分析。

圖4 不同料液比對(duì)金銀花總黃酮提取的影響

2.2.4 不同提取時(shí)間對(duì)金銀花總黃酮提取的影響 精確稱量金銀花樣品5.0 g，選取超聲時(shí)間30、40、50、60、70 min，乙醇濃度55%，料液比1∶40，超聲溫度55 ℃。提取時(shí)間對(duì)金銀花總黃酮提取率的影響見圖5。

圖5 不同提取時(shí)間對(duì)金銀花總黃酮提取的影響

由圖5可知，隨著溶劑在金銀花中慢慢地滲入，黃酮類化合物溶于乙醇溶液而被提取出來。如果增加適當(dāng)?shù)慕釙r(shí)間，可使提取物質(zhì)被更多地溶出。由圖5可知，當(dāng)提取時(shí)間為40～50 min時(shí)，黃酮的提取率最高達(dá)到1.59%；提取時(shí)間一旦超過50 min時(shí)，由于黃酮長時(shí)間在55 ℃的溫度下暴露，部分黃酮可能就會(huì)被氧化，從而導(dǎo)致其提取率降低。故選40、50、60 min進(jìn)行正交試驗(yàn)分析。

2.3 正交試驗(yàn)研究

2.3.1 因素與水平的確定 基于上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定以乙醇濃度(%)、超聲時(shí)間(min)、超聲溫度(℃)、料液比4個(gè)對(duì)金銀花超聲波法提取工藝影響的因素作為考察對(duì)象，以總黃酮得率作為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，因素與水平見表1。

表1 單因素與水平

2.3.2 正交試驗(yàn)分析 制備9份樣品，分別按表1進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以黃酮提取率為考察指標(biāo)進(jìn)行直觀分析，結(jié)果見表2。

從表2可以看出，極差最大的是A因素，其次為C因素、B因素，極差最小的是D因素，說明從金銀花超聲波輔助乙醇法提取總黃酮對(duì)含量影響最大的因素為超聲提取溫度，其次為料液比和乙醇濃度，提取時(shí)間的影響最小。

表2 正交試驗(yàn)直觀分析表

2.3.3 正交試驗(yàn)方差分析 商洛市金銀花超聲輔助法提取總黃酮正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果見表3。從金銀花超聲波輔助提取總黃酮的正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果可以看出(表4)，A因素(F0.05

表3 黃酮含量方差分析表

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

本文以乙醇為溶劑，利用超聲輔助法提取商洛市金銀花中總黃酮，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，結(jié)合正交試驗(yàn)分析，得出商洛市金銀花中綠原酸最佳提取工藝為：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%、超聲時(shí)間40 min、超聲溫度45 ℃、料液比1∶30，黃酮的提取率可達(dá)2.66%。

3.2 討論

以正交試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，參照最佳工藝參數(shù)對(duì)金銀花總黃酮進(jìn)行了提取，重復(fù)3次，得到金銀花總黃酮提取率約為2.66%，與梁萱等[27]工藝相比較得率(1.1118%)較高；與賈霖等[28]用乙醇回流法提取金銀花黃酮相比，使用超聲波輔助法提取金銀花黃酮顯然有著操作簡便、設(shè)備簡易、綠色經(jīng)濟(jì)特點(diǎn)；比起黃小梅等[29]用超聲波提取金銀花黃酮的提取時(shí)間(2 h)足足縮短了80 min，故做到了節(jié)省時(shí)間；李曉軍[30]所用溫度80 ℃，與之相比溫度較適中(45 ℃)，有效成分穩(wěn)定、不易分解，效率較高。

因此本試驗(yàn)提出的新工藝具有綜合成本低、污染較小、工藝簡易、提取效率較高的特點(diǎn)，并且在實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)工藝非常穩(wěn)定、重現(xiàn)性很好，可以為當(dāng)?shù)亟疸y花資源的可持續(xù)利用提供借鑒。除上述之外，超聲輔助法還可以有效地克服傳統(tǒng)煎煮法提取中藥材細(xì)粉易糊化、堵塞等問題。