異源表達CmSAMDC基因擬南芥的耐鹽性分析

劉長命,楊 娜,文 丹,路夢夢,明田田

(商洛學(xué)院,陜西 商洛 726000)

鹽脅迫是植物生長發(fā)育中最為嚴重的非生物脅迫因素之一。目前,全球被鹽漬化的陸地面積約占10%,中國的鹽漬土面積近1億hm2,并且有日趨擴大的趨勢。對植物耐鹽機理進行深入研究,將有助于培育耐鹽性強的植物品種,并對生態(tài)環(huán)境改善也具有積極的指導(dǎo)意義[1]。

近年來,多胺代謝途徑已被作為植物潛在抗性的研究目標,涉及多胺代謝的相關(guān)基因也越來越被重視。研究發(fā)現(xiàn),在遭受冷害[2]或鹽脅迫[3]時,黃瓜和向日葵的內(nèi)源多胺合成與代謝途徑都發(fā)生了改變,并且抗性品種能合成更多的多胺來抵御脅迫[4-6]。

19-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(SAMDC)是精胺和亞精胺合成過程中的關(guān)鍵酶,該酶參與了多數(shù)植物的抗性反應(yīng)過程[7]。作者前期研究[8-11]顯示,轉(zhuǎn)CmSAMDC基因的擬南芥植株對白粉病的抗性明顯增強。為了進一步探明CmSAMDC基因在響應(yīng)非生物脅迫中的作用,本研究以已獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥為材料,對其耐鹽性進行了分析,以期為利用該基因進行甜瓜耐鹽性改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)基因擬南芥株系TA1、TB1為前期研究獲得,將野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代種子消毒和清洗干凈，待用。

1.2 方法

1.2.1 目標基因的定量和半定量表達分析 選取6周齡T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株葉片,利用引物CmSAMDC F:5′-ATCAAAACTTGCGGCACTAC-3′和CmSAMDC R:5′-AGCACCCTCACAATCAACTTAG-3′進行定量和半定量分析。實時定量程序為:95 ℃ 30 s;95 ℃ 20 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,40個循環(huán)；以擬南芥的Actin2基因作為內(nèi)參。半定量程序為:94 ℃ 2 min;94 ℃ 20 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,25個循環(huán);72 ℃ 10 min。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥發(fā)芽率的測定 將T3轉(zhuǎn)基因植株和野生型擬南芥的種子用75%酒精和10% NaClO消毒，然后隨機取100粒,播于含不同濃度(0、100、150、200、300 mmol/L)NaCl的MS培養(yǎng)基上,6 d后統(tǒng)計發(fā)芽情況。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的根長及側(cè)根數(shù)測定 將MS培養(yǎng)基上生長15 d的T3代轉(zhuǎn)基因幼苗和野生型擬南芥幼苗移至含不同濃度(0、100、150、200、300 mmol/L)NaCl的MS培養(yǎng)基上,繼續(xù)生長15 d后測定其根長和側(cè)根數(shù)。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的耐鹽性鑒定 將MS培養(yǎng)基上生長15 d的T3代轉(zhuǎn)基因幼苗和野生型擬南芥幼苗移栽入盆(培養(yǎng)基質(zhì)為蛭石∶壤土∶草木灰=1∶1∶1),培養(yǎng)至4周齡時,每穴分別澆灌15 mL 200 mmol/L或400 mmol/L NaCl溶液,每2 d澆灌1次,在處理12 d后測定脂質(zhì)過氧化水平(MDA含量)。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥激素含量的測定 油菜素內(nèi)酯(Brassinolide, BR)、茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate, JA-me)、脫落酸(Abscisic acid, ABA)、赤霉素(Gibberellin, GA)、吲哚丙酸(Indole propionic acid, IPA)、玉米素(Zeatin riboside, ZR)和吲哚乙酸(Indole acetic acid, IAA)的提取參照黃志[12]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標基因的表達分析

通過轉(zhuǎn)基因植株篩選,并對轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代植株進行CmSAMDC基因表達分析，結(jié)果(圖1)顯示,CmSAMDC基因成功在轉(zhuǎn)基因株系TA1和TB1中表達。

TA1和TB1代表轉(zhuǎn)基因株系；WT代表野生型擬南芥。下同。

2.2 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥的發(fā)芽率

對轉(zhuǎn)基因T3代株系TA1、TB1和野生型擬南芥植株(WT)的種子發(fā)芽率進行觀察，發(fā)現(xiàn)：在含100、150、200 mmol/L NaCl條件下,轉(zhuǎn)基因T3代種子的發(fā)芽率分別為86%、70%和45%,而野生型擬南芥種子的發(fā)芽率分別為75%、58%和25%,T3代種子的發(fā)芽率均顯著高于野生型植株的；而在不含鹽溶液(0 mmol/L)的MS培養(yǎng)基上,兩者的種子發(fā)芽率無顯著性差異(圖2)。

2.3 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的根長及側(cè)根數(shù)

對根系觀察結(jié)果(圖3)顯示：在不含鹽溶液(0 mmol/L)的MS培養(yǎng)基上,轉(zhuǎn)基因T3代植株的根長略大于野生型植株,但差異未達到顯著性水平，側(cè)根數(shù)也無顯著性差異；在100 mmol/L鹽脅迫條件下,T3代植株的側(cè)根數(shù)明顯多于野生型植株,差異達到了極顯著水平,而根長無顯著差異;在150 mmol/L鹽脅迫條件下,T3代植株的側(cè)根數(shù)和根長均顯著高于野生型植株;在200 mmol/L鹽脅迫條件下,兩種材料的根系和側(cè)根生長均受到了明顯抑制。

2.4 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的生長情況

將MS培養(yǎng)基上15日齡的幼苗進行移栽,緩苗3 d后隔日澆1次不同濃度的NaCl溶液。用200 mmol/L鹽溶液處理8 d后,轉(zhuǎn)基因植株與對照植株(CK)生長基本一致,而野生型植株的葉片呈現(xiàn)輕微黃化;在處理16 d后,野生型植株明顯小于轉(zhuǎn)基因植株。用400 mmol/L鹽溶液處理8 d后,轉(zhuǎn)基因植株生長受阻,但較野生型植株的受阻程度要輕;處理16 d后,野生型植株已經(jīng)死亡,而轉(zhuǎn)基因植株仍能繼續(xù)存活(圖4A)。經(jīng)不同濃度鹽溶液處理后12 d,植株的脂質(zhì)過氧化程度(MDA含量)存在顯著性差異,即經(jīng)200 mmol/L與400 mmol/L濃度鹽溶液處理12 d后，TA1植株的MDA含量比對照分別上升了50%和196%, TB1比對照分別上升了28%和150%,野生型植株比對照分別上升了92%和376%。總體來看,轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的耐鹽性明顯強于野生型擬南芥。

圖2 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥的發(fā)芽率

A:轉(zhuǎn)基因T3代和WT幼苗根系的生長情況; B:轉(zhuǎn)基因T3代和WT幼苗的相對根長; C:轉(zhuǎn)基因T3代和WT幼苗的側(cè)根數(shù)。

A:鹽脅迫后8 d和16 d的植株表型; B:鹽脅迫后12 d的MDA含量(鮮重)。

2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株激素含量的變化

對轉(zhuǎn)基因株系TA1和TB1的內(nèi)源激素含量測定的結(jié)果(圖5)表明：GA、ZR、IPA、IAA的含量均表現(xiàn)為TA1>WT>TB1; BR含量表現(xiàn)為兩個轉(zhuǎn)基因植株高于WT植株,而JA-me含量卻同時低于WT; ABA的含量呈現(xiàn)為WT>TB1>TA1。各激素含量在轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株間未表現(xiàn)出規(guī)律性的對應(yīng)關(guān)系。

圖5 轉(zhuǎn)CmSAMDC基因擬南芥植株激素含量(鮮重)的變化

3 討論

植物在長期進化中,常通過調(diào)控細胞內(nèi)基因表達水平來調(diào)節(jié)脅迫應(yīng)答保護機制。SAMDC是Spd和Spm合成的關(guān)鍵基因,它涉及到眾多植物對非生物脅迫和生物脅迫的抗性反應(yīng)過程,在植物生長發(fā)育、代謝調(diào)控及脅迫響應(yīng)中均具有重要的作用[13-15]。Hazarika研究表明[4],SAMDC基因廣泛涉及冷害、高溫及鹽脅迫等的抗性反應(yīng),且一些轉(zhuǎn)SAMDC基因的植物表現(xiàn)出了對外界脅迫的廣譜抗性。Roy and Wu[16]利用六倍體小麥的SAMDC基因進行水稻轉(zhuǎn)化,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻在鹽脅迫下仍能正常生長發(fā)育,其內(nèi)源亞精胺和精胺含量增加達3～4倍。Franceschetti等[17]將擬南芥的SAMDC基因轉(zhuǎn)入煙草,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出了多種脅迫抗性。Waie and Rajam[18]用人的SAMDC基因轉(zhuǎn)化煙草,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草對干旱和鹽脅迫表現(xiàn)出更高的抗性。Peremarti等研究還認為, spd和spm在抵御干旱脅迫中可能起著清除自由基的作用[19]。本研究也發(fā)現(xiàn),在100或150 mmol/L NaCl脅迫下,轉(zhuǎn)CmSAMDC基因擬南芥植株的根長和側(cè)根數(shù)均多于野生型植株;在對4周齡轉(zhuǎn)基因植株幼苗澆灌不同濃度的鹽溶液時,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株較野生型植株具有更強的耐鹽性。

在植物受到脅迫后,多胺在次生代謝調(diào)控及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在鹽脅迫下的MDA含量較野生型低,說明轉(zhuǎn)CmSAMDC基因擬南芥植株在受到外界脅迫時,為了減少活性氧積累造成的傷害,會激發(fā)多種信號物質(zhì),如多胺,協(xié)調(diào)各種活性氧清除系統(tǒng),達到體內(nèi)活性氧的代謝平衡。但是,CmSAMDC基因和多胺類物質(zhì)是如何參與植株的耐鹽性調(diào)控還不得而知。今后有必要對多胺代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò),以及由其直接或間接調(diào)控的潛在抗性基因或物質(zhì)進行進一步探討。