乳腺癌中Treg的浸潤水平與臨床預后的關系及與β-catenin的相關性*

趙娜， 戢楠楠， 蘇文利， 肖少清

海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院放療科(海南?？?573011)

乳腺癌仍然是全球女性中最常見的癌癥，盡管近年來女性乳腺癌患者其隨著早期診治及聯(lián)合治療的臨床應用其總體的生存率有所提高，但其仍然是多數(shù)女性癌癥患者死亡的主要原因[1]。腫瘤細胞與免疫系統(tǒng)之間的相互作用對于癌癥的發(fā)生和病情進展具有重要的作用[2]。越來越多的回顧性和前瞻性研究顯示乳腺癌中高水平的淋巴細胞浸潤與患者的預后顯著相關，特別是三陰性乳腺癌和富含HER2陽性表達的乳腺癌組織[3]。此外，腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-infiltrating lymphocyte，TIL)的存在可影響新輔助化療的治療應答[4]。因此，了解TIL與乳腺癌臨床特征及對乳腺癌調(diào)控機制對乳腺癌的免疫治療具有重要意義。Wnt通路在不但在腫瘤進展中起關鍵作用，同時也調(diào)控著免疫系統(tǒng)[5]。在外周免疫中，經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號傳導調(diào)控成熟T淋巴細胞的極化，分化和存活[6]。據(jù)報道，Wnt/β-catenin途徑的激活可能負向調(diào)節(jié)人T淋巴細胞中初始效應T細胞的分化[7]。同時Wnt/β-catenin信號通路還抑制樹突細胞對Toll樣受體配體誘導產(chǎn)生促炎性細胞因子，并促進調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)的樹突狀細胞(DC)產(chǎn)生，從而重編樹突細胞導致免疫耐受反應[8]。Wnt信號通常在各種癌癥中被激活[9]，腫瘤細胞和組織中β-catenin的蓄積通過直接結合白細胞介素-10(IL-10)啟動子來上調(diào)IL-10的表達，從而參與腫瘤相關樹突細胞進行免疫調(diào)控。既往研究在小鼠模型中，Wnt通路的激活阻止了CD8+T細胞分化成效應T細胞，揭示W(wǎng)nt/β-catenin途徑可能有助于維持成熟CD8+T細胞的干細胞性，表明Wnt/β-catenin途徑在用于癌癥的過繼性T細胞治療中的潛在價值。據(jù)報道，高β-catenin活性與乳腺癌預后不良和腫瘤進展相關[10]。我們之前的研究結果還表明Wnt/β-catenin途徑在乳腺癌中異常激活，并且可能在該疾病中具有機械和藥理學意義。高水平Tregs浸潤的乳腺癌患者其生存率顯著降低[11]，但對于Treg在乳腺癌組織中的浸潤水平與乳腺癌中β-catenin表達的關系仍未明確。因此，本研究旨在探討乳腺癌中Treg的浸潤水平與β-catenin的相關性及對患者臨床特征及預后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年1月至2015年2月于我院治療的乳腺癌患者共127例，納入標準：(1)病理確診為乳腺癌；(2)無臨床遠處轉移；(3)未行新輔助放化療；(4)獲得完整隨訪。排除標準：(1)病歷資料不完整；(2)失訪的患者；(3)合并機體免疫性疾病的患者；(4)長期使用類固醇藥物治療的患者；(5)合并多種腫瘤的患者。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會審核并批準。127例乳腺癌患者，年齡36～68歲，平均(52.3±8.6)歲。

1.2 免疫組化檢測 將選定的甲醛溶液固定石蠟包埋組織塊的以5 μm厚度進行連續(xù)切片，切割到固定載玻片上。將組織在二甲苯中脫蠟并再水化。在檸檬酸鹽緩沖液中進行熱誘導抗原修復(高壓蒸煮3 min)后，用過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。將切片與10%山羊血清一起孵育以減少非特異性結合和背景染色。優(yōu)化兔單克隆抗體的使用條件，并且以FOXP3(#98377，1∶200稀釋，CST)和β-catenin(#8480，1∶200稀釋，CST)使用抗體，4℃一抗孵育過夜。然后載玻片用含有0.05%Tween的Tris緩沖鹽水洗滌。隨后在室溫下與HRP標記的山羊二抗標記。使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)作為底物進行變色反應，然后將載玻片用蘇木精復染，干燥后使用顯微鏡進行鏡下計數(shù)。

1.3 免疫組化統(tǒng)計 讓兩位有經(jīng)驗的病理師在高倍鏡下(200×)評估腫瘤組織中FOXP3+的Tregs浸潤水平,Tregs和β-catenin的評估均隨機選擇5個鏡面評估后取平均值。根據(jù)Tregs在視野下浸潤的比例，其中Tregs≥20個/高倍鏡的細胞比例被認為是Tregs高浸潤，<20個/高倍鏡為Tregs低浸潤。β-catenin的表達水平通過復合表達評分(composite expression score，CES)進行評估。β-catenin染色的評估包括染色強度(分類為：0，無染色; 1，弱染色; 2，中等染色; 3，強染色)和陽性癌細胞的比例(分類為0：<5%; 1：5%～25%; 2：26%～50%; 3：51%～75%;4：76%～100%)。在統(tǒng)計分析中，將上述兩個值相乘以獲得CES，基于癌組織的CES，將患者分為兩組，β-catenin低表達(CES<6)和NAMPT高表達(CES≥6)。

1.4 臨床資料收集及分析方法 對比患者的不同年齡、腫瘤大小、病理分級、淋巴結轉移情況，人表皮生長因子受體2(HER2)、雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)表達的Tregs浸潤情況，分析Tregs浸潤與β-catenin的表達水平的關系，記錄所有患者的隨訪的生存情況，對比不同Tregs浸潤與β-catenin的表達水平患者的預后情況。

2 結果

2.1 Tregs浸潤水平與臨床特征的關系 127例乳腺癌患者中，Tregs高浸潤的共69例，低浸潤共58例，其中不同年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移、HER2和不同分期的乳腺癌組織中Tregs浸潤水平比例對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。而組織分級為Ⅲ級的患者乳腺癌組織中Tregs高浸潤水平比例顯著高于Ⅰ～Ⅱ級(2=4.806，P=0.028)；ER和PR陰性的Tregs高浸潤水平比例顯著高于ER和PR陽性(2=9.976，P=0.002；2=4.733，P=0.030)，見表1。

表1 乳腺癌組織中Tregs浸潤水平與臨床特征的關系 例(%)

2.2 Tregs浸潤水平與β-catenin表達的關系 127例乳腺癌組織中Tregs浸潤水平與β-catenin表達的CES評分呈顯著正相關(r=0.677，P<0.001)(圖1)，乳腺癌組織Tregs浸潤與β-catenin表達見圖2。

圖1 Tregs浸潤水平與β-catenin表達CES評分相關性的散點圖

2.3 Tregs浸潤水平與β-catenin表達對乳腺患者預后的影響 不同的Tregs浸潤水平與β-catenin表達的總體生存率對比中，Tregs高浸潤水平合并β-catenin高表達患者的總體生存率最差，為53.1%，而Tregs低浸潤水平合并β-catenin低表達總體生存率最好，為87.2%，Tregs高浸潤水平合并β-catenin高表達患者的總體生存率顯著差于Tregs低浸潤水平合并β-catenin低表達的患者，差異有統(tǒng)計學意義(HR=3.770，P<0.001)，見圖3。

A：乳腺癌Tregs高浸潤；B：乳腺癌Tregs低浸潤；C：β-catenin高表達；D：β-catenin低表達

圖3 不同Tregs浸潤水平與β-catenin表達乳腺患者的總體生存率對比

3 討論

腫瘤微環(huán)境中的TIL主要負責腫瘤內(nèi)的免疫應答。通過免疫組織化學技術檢測TIL在腫瘤中的浸潤水平是預測腫瘤免疫反應的重要指標。此外，TIL的存在顯示了患者對放化療及免疫治療反應的預測作用，并可能有助于臨床醫(yī)生對腫瘤中免疫細胞的浸潤水平進行評估以確定患者的預后情況[12]。其中既往研究已經(jīng)顯示Tregs在對于乳腺癌的病情進展中具有重要作用，但對于Tregs在乳腺癌中與β-catenin的關系仍未明確[13]。因此，本研究進一步分析了Tregs在乳腺癌中的浸潤水平以及與β-catenin表達的相關性。我們的結果顯示ER/PR狀態(tài)與腫瘤組織Tregs之間存在顯著相關性。同時，病理級別更高的患者其Tregs浸潤水平顯著升高，本結果部分與國外研究的數(shù)據(jù)相類似[14]，進一步研究明確了Tregs浸潤水平與β-catenin表達呈顯著正相關，Tregs高浸潤水平與β-catenin高表達嚴重影響了患者的預后，這顯示了乳腺癌中Tregs浸潤可能參與了β-catenin的調(diào)控，促進了腫瘤的病情進展。

β-catenin是經(jīng)典Wnt/β-catenin通路的關鍵因子，它主要參與轉錄調(diào)控多種的下游基因，并在癌癥中發(fā)揮重要的作用。在沒有Wnt信號傳導的情況下，β-catenin被β-catenin破壞復合物進行降解。當被Wnt配體激活時，卷曲蛋白和低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)受體的共激活誘導破壞復合物的抑制，因此在細胞質(zhì)中穩(wěn)定β-catenin。β-catenin最終易位于核內(nèi)，調(diào)節(jié)各種靶基因的表達[15]。β-catenin在各種惡性腫瘤中積累，這與Wnt/β-catenin途徑在癌變和腫瘤發(fā)展過程中異?；罨嘘P[16]。既往研究[17]表明，Wnt/β-catenin信號的改變也存在于超過60%的乳腺癌中，并可預測患者的不良預后。越來越多的研究表明Wnt/β-catenin信號對腫瘤免疫系統(tǒng)產(chǎn)生顯著影響。它通過調(diào)節(jié)一些關鍵的細胞因子和免疫細胞的功能誘導免疫抑制和抵抗[18]。惡性腫瘤中Wnt/β-catenin途徑的失調(diào)可能有助于癌癥免疫逃避和對免疫療法的抵抗。

在乳腺癌組織中，高水平的CD8+淋巴細胞浸潤預示著患者更好的預后，而高密度的FOXP3+Tregs往往與不良的生存預后有關[19]。而Tregs高度浸潤和β-catenin高表達患者的預后最差，這些結果表明Wnt/β-catenin途徑可能在T細胞功能上起重要的作用。根據(jù)體外模型的結果，Tregs與靶細胞接觸后可誘導免疫抑制[20]，但對于Tregs與Wnt/β-catenin具體的分子機制，仍需要進一步深入研究。

綜上所述，乳腺癌中Treg的浸潤水平與ER/PR狀態(tài)及β-catenin的表達相關，乳腺癌組織中Tregs高浸潤水平合并β-catenin高表達是患者預后的不良的風險因素。