胃癌患者伊立替康耐藥前后基因表達譜的差異*

趙素芳， 李冬兵， 孫大勇△

1深圳市第二人民醫(yī)院消化科(廣東深圳 518035)； 2廣州邁景基因醫(yī)學(xué)科技有限公司(廣東廣州 510300)

胃癌嚴(yán)重威脅到人類的身體健康。胃癌是世上第三大常見的腫瘤，全球每年有約一百萬人被診斷患有胃癌。2015年，中國新增癌癥病例約429.2萬例，癌癥死亡人數(shù)約281.4萬，其中胃癌，在癌癥死亡原因中排在前列[1]。研究表明一線和二線化療對于晚期或轉(zhuǎn)移性胃癌患者在生存率方面有一定的益處。胃癌治療的手段有很多，包括手術(shù)治療和藥物治療等。大多數(shù)胃癌在確診時，屬于部分進展或長遠轉(zhuǎn)移的晚期患者。這類患者不宜采用手術(shù)治療，最佳治療手段是以全身化療為主的藥物綜合治療，可以延長患者的生存時間，同時提高患者生存質(zhì)量[2]。鹽酸伊立替康是一種DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅰ抑制劑，可阻斷拓撲異構(gòu)酶切割復(fù)合物的DNA重新連接[3]。伊立替康的體內(nèi)水解產(chǎn)物為7-乙基-10羥基喜樹堿，研究發(fā)現(xiàn)，與伊立替康自身相比，該水解產(chǎn)物的抗腫瘤活性更高[4]。與DNA拓撲異構(gòu)酶結(jié)合進而阻斷DNA鏈的組裝，引起DNA鏈斷裂，干擾DNA復(fù)制最終發(fā)揮抗腫瘤作用，這是伊立替康及其水解產(chǎn)物的抗腫瘤機制。伊立替康對增生的腫瘤細胞具有很強的殺傷活性在于腫瘤細胞中DNA拓撲異構(gòu)酶含量升高，研究發(fā)現(xiàn)伊立替康具有廣譜抗腫瘤活性，且對多耐藥腫瘤依然有效[5]。研究發(fā)現(xiàn)單一伊立替康用藥相比于伊立替康聯(lián)合順鉑用藥來治療胃癌，臨床療效無顯著性差異，但不良反應(yīng)發(fā)生率明顯降低，結(jié)果表明單一伊立替康用藥方案不良反應(yīng)更小，安全性較高，值得推廣[6]。一些患者在使用伊立替康后產(chǎn)生耐藥。耐藥性的發(fā)展是胃癌治療中的主要障礙。研究發(fā)現(xiàn)伊立替康金屬硫蛋白MT1X的誘導(dǎo)上調(diào)，可能與胃癌患者的伊立替康耐藥有關(guān)[7]。因此，對于腫瘤耐藥性產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)的研究顯得尤為重要，這為解決胃癌耐藥后的進一步有效治療提供了一定的依據(jù)?；赗NA-Seq這一高通量測序方法，能夠有效地獲得目標(biāo)腫瘤組織在特定時期的幾乎所有基因表達的信息。這些信息包括部分已知熱點基因的表達水平的變化和剪接變異，部分稀有基因的表達水平的變化和剪接變異，部分未知基因的表達水平的變化和剪接變異。這些信息有利于我們?nèi)娣治霾煌瑯颖局g基因表達的差異。我們可以采用RNA-Seq來分析鑒定哪些基因的表達水平的差異和剪接變異造成了患者的耐藥，篩選這些化療耐藥相關(guān)的基因并深入分析相關(guān)基因的作用機制，對于腫瘤患者的個體化精準(zhǔn)治療中具有重要的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 入組患者均被診斷為胃低分化腺癌，用藥情況均為伊利替康單藥，這些患者在2015年1月至2017年1月期間使用伊利替康后均產(chǎn)生耐藥?；颊咝彰謩e為SHD、HDL、TYT、WYM、MQ和LCP。SHD：男性，85歲，病理診斷為胃竇粘膜低分化腺癌；HDL：男性，55歲，病理診斷為(全胃)胃低分化腺癌；TYT: 男性，70歲，病理診斷為(胃)低分化腺癌；WYM：女性，50歲，病理診斷為低分化腺癌；MQ：男性，47歲，病理診斷為低分化腺癌；LCP：女性，65歲，病理診斷為中高分化腺癌。入組患者首先均被履行告知義務(wù)，接著簽署知情同意書。按照國家和國際倫理學(xué)的有關(guān)要求，對樣本進行收集，包括A組：確診為胃癌患者，伊立替康用藥前樣本(SHD-before、HDL-before、TYT-before、WYM-before、MQ-before和LCP-before)，及B組：確診為胃癌患者，伊立替康用藥后樣本(SHD-after、HDL-after、TYT-after、WYM-after、MQ-after和LCP-after)，樣本均為穿刺組織樣本，用于RNA提取的樣品不低于2 g，至于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩颖卷毾冗M行病理切片診斷。

1.2 方法

1.2.1 文庫構(gòu)建 利用RNA提取試劑盒AllPrep DNA/RNA Mini Kit(QIAGEN，Cat No./ID: 80204)進行組織Total RNA的提取，檢測樣品核酸的濃度；采用RNA建庫試劑盒 mRNA Hyper Prep Kit(KAPA，KK8580)進行高通量測序文庫的構(gòu)建。具體的操作步驟參照試劑盒說明書；采用Qubit和qPCR對文庫質(zhì)量進行檢測，判斷文庫是否符合上機標(biāo)準(zhǔn)；對質(zhì)檢合格的文庫進行上機測序。

1.2.2 測序 使用Ⅱlumina測序平臺，對基于耐藥前后的組織構(gòu)建的文庫進行測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 差異表達基因：通過生物信息學(xué)分析軟件，獲得耐藥前后組織樣本中基因表達水平的相關(guān)信息，同時篩選出耐藥前后組織樣本中的差異表達基因(FDR<0.05)。腫瘤耐藥的特異差異表達基因的定義：基于不同患者差異表達的基因篩選出來的相同基因。

GO功能和KEGG pathway的富集分析(差異表達基因)：基于GO FAT 和KEGG pathway進行候選基因的功能注釋。

2 結(jié)果

2.1 原始下機數(shù)據(jù)的質(zhì)控 基于Genome Analyzer Ⅱx 測序儀(Ⅱlumina)進行RNA-Seq雙端測序，測得的原始堿基數(shù)目范圍為62 926 168～109 079 180，見表1。在參考基因組參考序列上，利用軟件進行比對，結(jié)果表明所獲得的堿基和參考基因組的匹配度范圍達88.17%～93.27%，見表1。這些Reads在基因組和轉(zhuǎn)錄組上的分布比較均勻，覆蓋比較完整，見表2、3。這些序列的測序深度接近50*；說明樣品的cDNA文件構(gòu)建比較成功。

2.2 差異表達基因 本研究采用RNA-seq方法，在耐藥前后的組織樣本中分別檢測到22 003和21 127表達基因，所得到的差異基因匯總數(shù)據(jù)見表4、5。其中差異基因數(shù)目為15 970個基因，達到顯著差異水平的基因有541個，達到極顯著差異水平的基因有148個。本研究中發(fā)現(xiàn)的541個突變基因(P值<0.05)與之前的研究結(jié)果進行交叉分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ABCA3、ADAMTS15、ALMS1、BCL2L11、C1QTNF6、CAPN9、COL12A1、COL5A3、COL7A1、IRF4、KRAS、MPP6、PCDHA1、PIK3CA、POU2AF1、USP13等16個基因也有發(fā)現(xiàn)。這些基因的變異可以對患者使用伊立替康藥物進行監(jiān)測。經(jīng)過分析可以得到2個用于顯示兩組樣本數(shù)據(jù)的顯著性差異的因素，一個因素是樣本間基因表達的差異倍數(shù)(fold change)，以2為底的對數(shù)變換；另一個因素是t檢驗所得到的P值，以10為底的對數(shù)變換。基于2個因素共同繪制火山圖(圖1)，其中橫坐標(biāo)為差異倍數(shù)，縱坐標(biāo)為差異的顯著性P值，紅色及藍色的點均代表差異表達變化達到顯著性水平(fold change>1.2倍且P值<0.05)的基因，黑色點代表無顯著差異表達變化的基因。通過進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)SHD-before、HDL-before、TYT-before、WYM-before、MQ-before和LCP-before為一組，SHD-after、HDL-after、TYT-after、WYM-after、MQ-after和LCP-after為一組，這與這些患者的臨床樣本分組結(jié)果是一致的，證明基于這種算法的分組的后續(xù)分析是有意義的。GO功能分析包括生物過程(biological Process，BP)(圖2)、分子功能(molecular Function，MF)(圖3)和細胞組分(cellular component，nent，CC)(圖4)?？v坐標(biāo)代表每個功能分類下的差異基因數(shù)目；條形圖顏色代表富集的GO功能分類的顯著性(P值基于Fisher′s Exact Test計算得到)，P值的大小與顏色梯度有關(guān)，以藍色為背景色漸變，越接近深藍色P值則越小，相對應(yīng)的KEGG通路富集的顯著性水平越高。通過GO分析，可以發(fā)現(xiàn)達到極顯著差異水平的基因有148個，將這148個基因按照表達量的上調(diào)和下調(diào)進行了歸類，整理成了表6、7兩組數(shù)據(jù)。我們將得到的差異表達基因與目前已有的數(shù)據(jù)庫進行關(guān)聯(lián)分析，最終明確與胃癌患者產(chǎn)生伊立替康耐藥密切相關(guān)的基因包括ABCA3、ADAMTS15、ALMS1、BCL2L11、C1QTNF6、CAPN9、COL12A1、COL5A3、COL7A1、IRF4、KRAS、MPP6、PCDHA1、PIK3CA、POU2AF1和USP13等，可以用于胃癌患者產(chǎn)生伊立替康耐藥機制的后續(xù)研究。

表1 樣本轉(zhuǎn)錄組測序的質(zhì)控統(tǒng)計表

表2 樣本轉(zhuǎn)錄組測序的Genome mapping統(tǒng)計表

表3 組織樣本轉(zhuǎn)錄組測序的Transcriptome Mapping統(tǒng)計表

圖1 B/A組火山圖

表4 樣本的分組信息及差異基因數(shù)目

表5 差異基因的數(shù)目

圖3 B/A組GO功能富集分析(Cellular Component，CC細胞組分)

圖4 B/A組GO功能富集分析(Molecular Function，MF分子功能)

2.3 差異表達的KEGG分析 在生物體內(nèi)，基因不是獨立地行使各自的功能，而是通過相互協(xié)調(diào)來完成一系列生化反應(yīng)并最終產(chǎn)生一系列生物學(xué)功能。KEGG通路分析有助于全面了解腫瘤的異質(zhì)化、發(fā)生及發(fā)展，耐藥的產(chǎn)生機制等。在進行KEGG通路分析時，基于篩選出來的差異基因，以KEGG通路為單位，通過Fisher′s Exact Test，來分析計算各個通路基因富集度的顯著性水平，最終確定表達水平的變化達到顯著性差異的代謝或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。其中，橫坐標(biāo)代表可以顯著富集的KEGG通路；縱坐標(biāo)代表每條KEGG通路中表達水平達到顯著性差異的基因數(shù)目；條形圖顏色表示富集的KEGG通路的顯著性差異，P值基于Fisher′s Exact Test計算得到，P值的大小與顏色梯度有關(guān)，以藍色為背景色漸變，越接近深藍色P值則越小，相對應(yīng)的KEGG通路富集的顯著性水平越高；條形圖上方的數(shù)字代表的是富集因子(rich factor)，富集因子的計算方法是特定KEGG通路的差異表達基因數(shù)目與參與該條通路的基因數(shù)目(所有鑒定到的基因)的比例。表8為差異基因的KEGG分析，我們可以看出差異表達基因的富集通路大多和PI3K-Akt 信號通路、胃酸分泌、黏附連接、蛋白質(zhì)的消化和吸收、細胞周期和膽汁分泌等相關(guān)。

表6 耐藥組織及其配對的用藥前組織的差異表達基因分析(上調(diào)基因)

表7 耐藥組織及其配對的用藥前組織的差異表達基因分析(下調(diào)基因)

3 討論

由于胃癌的發(fā)病機制及進展過程十分復(fù)雜，單個或者數(shù)個基因的研究往往不夠全面；系統(tǒng)的檢測樣本中基因的表達改變有助于同步獲取樣本中的表達譜，篩選出哪些基因發(fā)生了達到顯著性差異水平的表達變化，進而為尋找與胃癌耐藥相關(guān)的基因、開發(fā)新的藥物作用分子靶點、了解疾病的預(yù)后等提供有利的數(shù)據(jù)信息?；谵D(zhuǎn)錄組測序我們能夠全面地獲取樣本中所有基因的表達水平的變化及剪接變異的信息，以RNA-Seq為代表的第2代高通量測序已經(jīng)成為腫瘤相關(guān)研究的重要手段[8-10]。

我們將用藥后組織視為實驗組，與用藥前組織進行比較，差異基因表達的變化與用藥有關(guān)，這些結(jié)果提示在胃癌患者接受化療的過程中一些基因突變會導(dǎo)致患者產(chǎn)生耐藥。

本研究運用轉(zhuǎn)錄組測序?qū)ξ赴┗颊吣退幗M織及其配對的用藥前組織進行了深度、全面的轉(zhuǎn)錄組測序，從這些差異表達基因中再篩選出與胃癌密切相關(guān)的基因，共篩選到16個差異表達的基因，后續(xù)將會通過擴大樣本檢測的方法進行鑒定，有望成為診斷胃癌用藥檢測的分子標(biāo)志物。

圖5 B/A組KEGG通路富集分析

表8 差異表達基因富集的KEGG通路

對差異表達基因進行KEGG通路分析后，結(jié)果表明差異表達基因富集在蛋白質(zhì)消化和吸收、藥物代謝-細胞色素P450、膽汁分泌、黏附連接、PI3K-Akt 信號通路、胃酸分泌、細胞色素 P450代謝和酪氨酸代謝等通路中，這些結(jié)果也暗示這些通路中的差異基因可能在通路之間有crosstalk，最終導(dǎo)致胃癌患者耐藥的產(chǎn)生。

研究發(fā)現(xiàn)MRP基因可能在胃癌和結(jié)腸癌細胞產(chǎn)生耐藥過程中起重要作用[11]。在健康人群中，HER-2/NEU處于非激活狀態(tài)，一些致癌因素會造成其結(jié)構(gòu)的改變或表達的異常，其表達進而被激活，最終引起細胞的惡性轉(zhuǎn)化[12]。三MMP-9基因(明膠酶B)，被激活后形成Ⅳ型膠原酶，會造成腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，機制是通過降解基底膜和ECM中的構(gòu)成蛋白來破壞腫瘤細胞周圍的ECM[13]。在腫瘤癌癥模型中，伊立替康耐藥伴隨著EGFR和Src信號傳導(dǎo)的上調(diào)[14]。一項基于胃癌患者腫瘤樣本的研究表明，c-Met受體mRNA表達水平越高，預(yù)示腫瘤的分化程度越差，導(dǎo)致腫瘤的深度浸潤及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移[15]。癌癥干細胞對伊立替康具有化學(xué)抗性，c-Met抑制劑可能是基于伊立替康的胃癌患者化療的有希望的靶分子[16]。SULF2和WRN甲基化患者對伊立替康的敏感性也高于其他患者(P<0.05)，SULF2和WRN啟動子甲基化檢測指示用于鑒定和靶向最敏感的胃癌亞群用于個性化CPT-11療法的潛在預(yù)測生物標(biāo)志物[17]。GAS通過降解p27Kip1有助于SGC7901細胞MDR的出現(xiàn)[18]。

本研究中篩選出的部分差異基因在其他腫瘤研究中有報道，但這些基因在胃癌研究中尚未見報道。這些基因在胃癌患者產(chǎn)生伊立替康耐藥過程中的具體作用機制有待進一步研究。