生物周期節(jié)律紊亂大鼠乳腺組織的蛋白質(zhì)組學(xué)研究*

崔博舒, 衣同輝, 郎尉雅, 劉惠銘, 劉洪羽, 王楊, 李正, 紀(jì)怡然△, 潘洪明△

1佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(黑龍江佳木斯154007)； 2齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(黑龍江齊齊哈爾161006)； 3齊齊哈爾市第一醫(yī)院病理科(黑龍江齊齊哈爾 161005)

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)明顯上升[1]。研究表明乳腺癌是多種因素共同作用所致的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，與遺傳、環(huán)境、心理等諸多因素相關(guān)[2-3]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期從事夜班工作的女性患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯增高[4-6]，提示生物周期節(jié)律紊亂可能是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素，然而其機(jī)制尚不完全清楚。晝夜節(jié)律是生物周期節(jié)律中受光照影響最大的一種節(jié)律性行為，包括睡眠、代謝、激素分泌、細(xì)胞增殖及凋亡等[7-9]多種生物行為及生理過(guò)程都存在著晝夜節(jié)律現(xiàn)象。近年來(lái)，生物周期節(jié)律紊亂在包括乳腺癌在內(nèi)的疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用已成為生命科學(xué)研究熱點(diǎn)之一，但其對(duì)乳腺組織及其信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的影響未見(jiàn)報(bào)道。本研究的2017年1月至2018年1月，本實(shí)驗(yàn)以大鼠的乳腺組織為樣本，采用高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，研究生物周期紊亂模型大鼠乳腺組織中蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，并對(duì)腫瘤相關(guān)信號(hào)通路蛋白進(jìn)行分析，探討生物周期節(jié)律紊亂與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 制備生物周期節(jié)律紊亂動(dòng)物模型及指標(biāo)評(píng)價(jià)

1.1.1 制備生物周期節(jié)律紊亂動(dòng)物模型 選用篩選合格的40只雌性SD大鼠，使用36W普通家庭采用的日光燈作為實(shí)驗(yàn)室光源，模擬大多數(shù)人作息的時(shí)間。按照隨機(jī)的方法分為生物周期節(jié)律紊亂實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在實(shí)驗(yàn)室中自然光照條件下飼養(yǎng)1周，以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室條件。從第2周開(kāi)始，對(duì)照組大鼠接受6:00—18:00光照/18:00—6:00黑暗的24 h光照周期。實(shí)驗(yàn)組大鼠接受每天光照時(shí)間為6:00—18:00光照/18:00—6:00黑暗以及22:00—10:00光照/10:00—22:00黑暗兩種光照制度，每3 d轉(zhuǎn)換1次，實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由攝水、攝食，觀察并記錄實(shí)驗(yàn)大鼠的行為變化。5周后對(duì)模型進(jìn)行指標(biāo)評(píng)價(jià)。

1.1.2 指標(biāo)評(píng)價(jià)

1.1.2.1 血清中雌二醇(E2)含量的檢測(cè) 腹主動(dòng)脈取血，取動(dòng)脈血2 mL，待凝固后，4℃，3 000 r/min，離心10 min后分離血清，操作步驟嚴(yán)格按照ELISA試劑盒上的說(shuō)明進(jìn)行。

1.1.2.2 熒光定量PCR 對(duì)兩組大鼠的下丘腦組織進(jìn)行取材，在液氮中速凍。采用Trion法提取RNA，按照Takara 公司The Prime Script First strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書(shū)中的方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)(PCR引物的合成由博士德生物公司合成)。

1.2 提取乳腺組織及應(yīng)用iTRAQ蛋白標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行乳腺組織蛋白質(zhì)表達(dá)的研究

1.2.1 乳腺組織的取材 將大鼠麻醉，找到第4對(duì)乳頭，使用鈍性剪刀沿腹中線切口，用兩對(duì)鉗子從腹膜上把皮膚剝離下來(lái)，將皮膚翻過(guò)來(lái)，在乳頭的外側(cè)區(qū)域即可以看見(jiàn)乳腺組織。

1.2.2 iTRAQ定量標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù) 首先，提取兩組大鼠乳腺組織蛋白，并對(duì)其進(jìn)行酶解及除鹽，根據(jù)iTRAQ-8標(biāo)試劑盒(SCIEX)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行標(biāo)記，將混合后的肽段運(yùn)用Ultimate 3000 HPLC系統(tǒng)(Thermo DINOEX，USA)對(duì)肽段樣品進(jìn)行分級(jí)分離。將多肽樣品溶解于2%乙腈/0.1%甲酸中，并應(yīng)用TripleTOF 5600+液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(SCIEX)進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，使用與Eksigent nanoLC系統(tǒng)(SCIEX，USA)偶聯(lián)的TripleTOF 5600plus質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。其次，進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定及定量，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兩兩樣品蛋白間顯著差異在差異倍數(shù)≥1.5或者≤0.67倍，P值≤0.05的條件下視為差異蛋白。最終，對(duì)所有鑒定蛋白和顯著性差異蛋白質(zhì)進(jìn)行GO、Pathway注釋結(jié)果以及顯著性差異蛋白的GO富集分析。

GO注釋分析總共有3個(gè)本體(ontology)，分別描述基因的分子功能(molecular function)、細(xì)胞組分(cellular component)、參與的生物過(guò)程(biological process)，該方法能夠?qū)Φ鞍走M(jìn)行分類，并研究蛋白生物過(guò)程，如細(xì)胞過(guò)程，如細(xì)胞增殖、周期、死亡和黏附等方面，代謝過(guò)程、應(yīng)激過(guò)程及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生物過(guò)程。Pathway代謝通路注釋分析能確定蛋白質(zhì)參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。GO功能顯著性富集分析給出與所有鑒定到的蛋白質(zhì)背景相比，差異蛋白質(zhì)中顯著富集的GO功能條目，從而給出差異蛋白質(zhì)與哪些生物學(xué)功能顯著相關(guān)。通過(guò)這些分析試圖挖掘有意義的蛋白。

2 結(jié)果

2.1 生物周期節(jié)律紊亂模型指標(biāo)評(píng)價(jià)結(jié)果

2.1.1 熒光定量PCR及行為學(xué)觀察的結(jié)果 經(jīng)熒光定量PCR方法檢測(cè)的數(shù)值得出，Bmal1的表達(dá)水平下調(diào)，其他生物鐘因子的表達(dá)呈不規(guī)律性變化(表1)，生物周期紊亂可導(dǎo)致主要的時(shí)鐘分子表達(dá)水平異常。生物周期節(jié)律紊亂組大鼠從第14天開(kāi)始白天活動(dòng)量增加，第30天出現(xiàn)脾氣煩躁等異常行為表現(xiàn)，其自身的晝伏夜出的節(jié)律性行為消失。

表1 大鼠乳腺組織中重要生物鐘基因熒光定量PCR相對(duì)表達(dá)量

*與對(duì)照組比較P<0.05

2.1.2 血清中E2含量的檢測(cè)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組大鼠血清中E2的含量為(132.8±8.7)pg/mL，對(duì)照組為(125.95±0.9)pg/mL，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組的大鼠血清中E2的含量有顯著升高(P<0.05)。結(jié)合熒光定量PCR中所測(cè)得下丘腦組織中生物鐘基因表達(dá)量的變化以及實(shí)驗(yàn)大鼠行為學(xué)改變，表明生物周期紊亂大鼠動(dòng)物模型制備成功。

2.2 iTRAQ定量標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果

2.2.1 蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果 本次實(shí)驗(yàn)中，質(zhì)譜產(chǎn)生的二級(jí)譜圖數(shù)、解析的二級(jí)譜圖數(shù)分別為273 211、57 346，鑒定到肽段數(shù)和蛋白數(shù)目為9 731和1 716，其中至少含有2個(gè)unique肽段的蛋白質(zhì)數(shù)目為1 264(鑒定到譜圖數(shù)和肽段數(shù)的可信度至少為95%)。

2.2.2 蛋白質(zhì)定量信息統(tǒng)計(jì)結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果共鑒定到1 716種蛋白(按照至少包含兩個(gè)獨(dú)立的肽段過(guò)濾，共鑒定到1 264種蛋白)，其中1 651種蛋白在實(shí)驗(yàn)中有定量結(jié)果，兩組中存在顯著差異的蛋白數(shù)為169種(其中顯著性差異蛋白質(zhì)數(shù)目按照上調(diào)≥1.5或下調(diào)≤0.67，P值≤0.05進(jìn)行相應(yīng)的篩選)。與對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組有60種蛋白表達(dá)上調(diào)，109種蛋白表達(dá)下調(diào)。

2.2.3 鑒定和差異蛋白質(zhì)功能注釋

2.2.3.1 GO注釋分析結(jié)果 本次實(shí)驗(yàn)對(duì)上調(diào)和下調(diào)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行獨(dú)立的功能注釋分析結(jié)果，可以看出上調(diào)和下調(diào)中的部分差異蛋白質(zhì)，能夠更加清楚地分析差異蛋白質(zhì)的功能。見(jiàn)表2。

表2 差異蛋白質(zhì)的 GO功能注釋結(jié)果

2.2.3.2 Pathway代謝通路注釋分析結(jié)果 Pathway代謝通路注釋到S組和D組中上調(diào)和下調(diào)差異蛋白質(zhì)數(shù)目排名前十的Pathway功能統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3，通過(guò)Pathway代謝通路注釋分析發(fā)現(xiàn)Tensin1、Glutathione S transferase theta2(谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶2)及Glutathione S transferase pi(谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶pi)與癌癥信號(hào)通路相關(guān)的生物分子表達(dá)量水平發(fā)生改變，Calmodulin-like5及Calmodulin-3參與褪黑激素的生成及GnRH信號(hào)通路的生物分子在周期節(jié)律紊亂組中表達(dá)水平降低，而參與Melanogenesis、GnRH、Calcium、Wnt、ErbB等多條信號(hào)通路的生物分子Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type Ⅱ subunit α在周期紊亂組中表達(dá)水平增高。

表3 差異蛋白質(zhì)的Pathway功能統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.2.4 差異蛋白的富集分析結(jié)果 差異蛋白質(zhì)GO功能富集結(jié)果中細(xì)胞組分顯著富集分析結(jié)果(top10)。見(jiàn)表4。

表4 差異蛋白細(xì)胞組分顯著富集分析結(jié)果 n(%)

3 討論

生物節(jié)律紊亂對(duì)腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程的影響已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)研究的新課題。體外試驗(yàn)檢測(cè)3種體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞所分泌的生物鐘基因Per-1、Clock水平，發(fā)現(xiàn)不同的癌細(xì)胞的同種生物鐘基因表達(dá)水平峰值、峰谷基本一致，這揭示了腫瘤的生長(zhǎng)可能受生物節(jié)律的調(diào)節(jié)[10]。大樣本人群研究發(fā)現(xiàn)生物鐘基因PER3基因型與乳腺癌的發(fā)病率相關(guān)聯(lián)，提示生物周期節(jié)律紊亂與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[11]，經(jīng)常從事夜班工作的女性人群患乳腺癌等與雌激素水平密切相關(guān)的惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)顯著增高[11-13]，然而生物周期紊亂通過(guò)何種機(jī)制影響乳腺癌等疾病發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程有待于進(jìn)一步闡明。為了探討生物周期節(jié)律紊亂與乳腺癌等疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，本研究采用蛋白組學(xué)的方法研究生物周期節(jié)律紊亂對(duì)大鼠乳腺組織中與乳腺癌等疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析，闡明生物周期節(jié)律紊亂與乳腺癌等乳腺疾病發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)聯(lián)。

應(yīng)用iTRAQ蛋白標(biāo)記技術(shù)、HPLC分離以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法，檢測(cè)生物周期節(jié)律紊亂實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組乳腺組織的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)鑒定到1 716種蛋白，兩組間存在差異的有169種，分析發(fā)現(xiàn)有54種蛋白是腫瘤相關(guān)的信號(hào)通路分子，其中Tensin1等9種蛋白的表達(dá)水平在兩組間有顯著差異。Tensin是可以結(jié)合到肌動(dòng)蛋白微絲的黏著分子，其氨基末端能與肌動(dòng)蛋白微絲相互作用[14]，在細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞骨架之間進(jìn)行跨膜連接，參與P53、胰島素、代謝等信號(hào)通路，與子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、小細(xì)胞肺癌及黑色素瘤相關(guān)。研究表明Tensin1可通過(guò)激活Cdc42調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[15-17]。Glutathione S transferase pi(GSTP)和Glutathione S transferase theta 2(GSTT2)都屬于谷胱甘肽(GSH)家族。早期研究發(fā)現(xiàn)GSTT2和乳腺癌治療反饋有關(guān)[18]，GSTP在惡性腫瘤組織中高表達(dá)，但在前列腺癌中表達(dá)降低[19]。GSTP還可以通過(guò)與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TRAF2)調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)信號(hào)通路[20]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)生物周期節(jié)律紊亂上調(diào)乳腺組織中Tensin1、GSTT2表達(dá)水平，而GSTP表達(dá)水平顯著下調(diào)，提示生物周期節(jié)律紊亂可以影響腫瘤相關(guān)的信號(hào)通路，進(jìn)而對(duì)乳腺癌等疾病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程產(chǎn)生影響。此外，乳腺癌是激素依賴性腫瘤，雌激素與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[21]，而褪黑激素不僅能抑制雌激素系統(tǒng)還能幫助調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律。本研究發(fā)現(xiàn)生物周期節(jié)律紊亂可以改變?nèi)橄俳M織中3種褪黑激素生成相關(guān)的蛋白表達(dá)水平。Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type Ⅱ subunit alpha參與Melanogenesis、GnRH、Calcium、Wnt、ErbB等信號(hào)通路中，在周期紊亂組中高表達(dá)。而Calmodulin-like 5及Calmodulin-3參與褪黑激素的生成及GnRH信號(hào)通路，在周期節(jié)律紊亂組中低表達(dá)。上述3種蛋白都參與褪黑激素的生產(chǎn)和GnRH信號(hào)通路中，提示生物周期節(jié)律紊亂可以干擾某些激素合成與分泌。

綜上所述，通過(guò)對(duì)光照條件改變所致的生物周期節(jié)律紊亂對(duì)大鼠乳腺組織蛋白組學(xué)研究，對(duì)乳腺癌等疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)生物周期節(jié)律紊可以改變大鼠的乳腺組織蛋白質(zhì)表達(dá)譜，Tensin1及Glutathione S transferase pi、Glutathione S transferase theta 2以及Calmodulin-like 5、Calmodulin-3等腫瘤和內(nèi)分泌相關(guān)蛋白表達(dá)水平發(fā)生改變，提示生物周期節(jié)律紊亂可以影響多種腫瘤及內(nèi)分泌相關(guān)信號(hào)通路，這也可能是生物周期紊亂人群乳腺癌等惡性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)增高的原因。研究結(jié)果提示人們應(yīng)盡量合理安排日常的作息時(shí)間，保持健康規(guī)律的生活和工作節(jié)奏，降低由于生物周期節(jié)律紊亂所致的疾病風(fēng)險(xiǎn)。在后續(xù)的研究中，將進(jìn)一步研究生物周期節(jié)律紊亂影響腫瘤及免疫相關(guān)信號(hào)通路的機(jī)制，闡明生物周期節(jié)律紊亂與乳腺癌等疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。