HPLC法測(cè)定安神補(bǔ)心片中6種成分含量

劉莉，李婷婷 ，何君怡

(1.成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，成都 610045；2.同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院，上海 200090)

安神補(bǔ)心片處方來(lái)源于國(guó)家藥品監(jiān)督管理局頒藥品標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為WS-11407(ZD-1407)-2002[1]。主要由丹參、石菖蒲、五味子(蒸)、首烏藤、墨旱蓮、合歡皮、菟絲子、女貞子、地黃、珍珠母共10味中藥組成。臨床用于治療心血不足、虛火內(nèi)擾所致的心悸失眠、頭暈耳鳴。方中丹參具活血通經(jīng)、清心除煩、養(yǎng)血安神等功效[2-3]，其中丹參酮ⅡA、丹酚酸B為丹參中主要有效成分[4-5]；五味子具鎮(zhèn)靜安神、收斂固澀、益氣生津、寧心安神的功效，主治心神失養(yǎng)之虛煩心悸、失眠多夢(mèng)等癥狀[6-8]，五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素為五味子主要有效成分[9-11]；首烏藤具有安五臟、和心志、養(yǎng)血、祛風(fēng)、止痛、鎮(zhèn)靜、催眠等作用，可調(diào)和陰陽(yáng)而促進(jìn)入睡，用于失眠多夢(mèng)、血虛身痛等[12-14]，2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷為2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定首烏藤中指標(biāo)性成分。原局頒標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)處方中丹參酮ⅡA進(jìn)行含量測(cè)定。近年來(lái)，相關(guān)含量測(cè)定方法已有很多報(bào)道[15-17]，但同時(shí)測(cè)定6個(gè)成分的方法筆者尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)參考上述參考文獻(xiàn)，經(jīng)多次摸索實(shí)驗(yàn)條件，建立了同時(shí)測(cè)定安神補(bǔ)心片中丹參酮ⅡA、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的高效液相色譜(HPLC)法。該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，靈敏度高，為安神補(bǔ)心片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供依據(jù)，對(duì)其質(zhì)量控制具有重要意義。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent1200高效液相色譜儀(包括G1311A四元泵，G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G1315D DAD二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司)；AE-240電子天平(德國(guó)賽多利斯公司，感量：0.01 mg)；AEG220電子天平(日本島津公司，感量：0.1 mg)；SK250H超聲儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；Millipore-Q Gradient 超純水裝置(美國(guó)密理博公司)。

1.2試藥 丹參酮ⅡA對(duì)照品(批號(hào)：110766-201721，含量：99.5%)、丹酚酸B對(duì)照品(批號(hào)：111562-201716，含量：94.1%)、五味子醇甲對(duì)照品(批號(hào)：110857-201714，含量：99.9%)、五味子甲素對(duì)照品(批號(hào)：111764-201714，含量：99.3%)、五味子乙素對(duì)照品(批號(hào)：110765-200710)、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品(批號(hào)：110844-201512，含量：91.0%)，均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；安神補(bǔ)心片(糖衣片，太極集團(tuán)四川綿陽(yáng)制藥有限公司，批號(hào)：1711004)、安神補(bǔ)心片(薄膜衣片，太極集團(tuán)四川綿陽(yáng)制藥有限公司，批號(hào)：1710004，1712005)、安神補(bǔ)心片(太極集團(tuán)浙江東方制藥有限公司，批號(hào)：17080012)、安神補(bǔ)心片(比智高藥業(yè)有限公司，批號(hào)：170501)；乙腈為色譜純，水為Millipore裝置制備的超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Sunfire C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為0.2%磷酸，梯度洗脫程序見(jiàn)表1；進(jìn)樣量5 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210，270和320 nm；柱溫35 ℃。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 取丹參酮ⅡA、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品，精密稱(chēng)定，置于25 mL量瓶中，加75%甲醇制成每毫升含丹參酮ⅡA 0.249 5 mg、丹酚酸B 0.762 2 mg、五味子醇甲0.277 7 mg、五味子甲素0.202 6 mg、五味子乙素0.247 6 mg、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷 0.197 6 mg溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。分別精密吸取上述對(duì)照品溶液適量，稀釋成不同濃度系列混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 取質(zhì)量差異項(xiàng)下本品，研勻，取1.0 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，即得。

2.3系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 按照“2.1”項(xiàng)色譜條件，取對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。在選定的色譜條件下，6種成分的理論板數(shù)均不低于200 000，色譜峰與相鄰峰的分離度均>1.5。

2.4線性關(guān)系考察 精密吸取不同濃度系列混合對(duì)照品溶液，分別依次進(jìn)樣，測(cè)定色譜峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一濃度混合對(duì)照溶液5 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其峰面積，結(jié)果丹參酮ⅡA、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的RSD分別為0.51%，0.59%，0.79%，0.56%，0.62%，0.56%。

2.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一安神補(bǔ)心片供試品溶液(批號(hào)：1710004)5 μL，分別于1，2，4，8，12，18，24 h進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積。結(jié)果丹參酮ⅡA、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的RSD分別為2.05%，1.82%，2.42%，2.05%，2.35%，1.27%。表明溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取安神補(bǔ)心片(批號(hào)：1710004)6份，按“2.2”項(xiàng)下樣品的制備處理樣品，按上述色譜條件，測(cè)定峰面積。結(jié)果樣品中丹參酮ⅡA、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的RSD分別為1.48%，1.22%，2.35%，2.17%，2.10%，1.45%。

A.混合對(duì)照品(210 nm)；B.混合對(duì)照品(270 nm)；C.混合對(duì)照品(320 nm)；D.供試品 (210 nm)；E.供試品 (270 nm)；F.供試品 (320 nm)；1.五味子醇甲；2.五味子甲素；3.五味子乙素；4.丹酚酸B；5.丹參酮ⅡA；6.2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷。

表2 6種有效成分回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.8回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量安神補(bǔ)心片(批號(hào)：1710004)0.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，按1：1比例精密添加丹參酮ⅡA、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品適量，按供試品制備方法處理，進(jìn)樣5 μL，測(cè)定。結(jié)果表明丹參酮ⅡA、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的回收率(n=6)分別為98.05%(RSD=1.14%)，99.25%(RSD=1.35%)，98.14%(RSD=1.89%)，97.80%(RSD=2.84%)，96.35%(RSD=2.09%)，99.16%(RSD=1.31%)。

2.9樣品的測(cè)定 取安神補(bǔ)心片5批，照供試品溶液制備方法處理，測(cè)定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 每片安神補(bǔ)心片中6種有效成分的含量 mg，n=3

3 討論

3.1檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 通過(guò)DAD檢測(cè)器，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，可知丹參酮ⅡA在270 nm處有最大吸收、丹酚酸B在240～340 nm波長(zhǎng)范圍吸收強(qiáng)度相似，故將丹參酮ⅡA、丹酚酸B的檢測(cè)波長(zhǎng)定為270 nm；五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素吸收曲線相似，在210 nm處均有較大吸收值，故將五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的檢測(cè)波長(zhǎng)定為210 nm；2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在 320 nm處有最大吸收，故將2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的檢測(cè)波長(zhǎng)定為320 nm。

3.2流動(dòng)相的選擇 分別以乙腈-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相，分別采用等度洗脫與梯度洗脫，流速均為1.0 mL·min-1，結(jié)果表明，等度洗脫不能有效地、高分辨地洗脫出全部對(duì)照品組分，特別是丹參酮ⅡA與五味乙素分離不好。而甲醇作為流動(dòng)相在210 nm的末端吸收影響大。乙腈-0.2%磷酸溶液梯度洗脫時(shí)，丹參酮ⅡA與五味乙素分離較好，且保留時(shí)間適中。故選擇乙腈-0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相。

3.3樣品處理方法的確定 分別考察甲醇、75%甲醇對(duì)供試品的提取結(jié)果的影響，根據(jù)測(cè)定結(jié)果、空白實(shí)驗(yàn)及回收率實(shí)驗(yàn)證實(shí)，75%甲醇提取既能排除干擾，又可以達(dá)到提取完全。故選擇75%甲醇為提取溶劑。另考察超聲處理與加熱回流及處理時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。結(jié)果表明超聲30 min已基本提取完全，且超聲處理與加熱回流效果相差不大，故確定提取方式為超聲處理30 min。