茜草藤水提物對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的作用*

張金玲，肖蒙，宋媛媛，貢雪芃，皮慧芳，李娟，杜光

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，咸寧 437100；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430030；3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，武漢 430030)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種累及回腸、直腸、結(jié)腸的特發(fā)性、慢性和復(fù)發(fā)性腸道炎癥性疾病，包括克羅恩病(Crohn’s disease, CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)，多見于青壯年。臨床表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、血便、體質(zhì)量減輕等。IBD過去多見于西方發(fā)達(dá)國(guó)家，近年來(lái),亞洲地區(qū)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，流行病學(xué)研究顯示我國(guó)炎癥性腸病的發(fā)病率高達(dá)3.44%，居亞洲之首[1]。由于高復(fù)發(fā)性，患者常常會(huì)因反復(fù)的腹瀉、腹痛、消化道出血、疲勞等不適癥狀，造成生活質(zhì)量下降，同時(shí)持續(xù)的藥物維持以及遠(yuǎn)期可能需要的外科干預(yù)讓患者承擔(dān)著嚴(yán)重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，占用了大量的社會(huì)醫(yī)療資源[2]。ZHANG等[3]研究認(rèn)為IBD是由遺傳、環(huán)境、腸道菌群和免疫應(yīng)答等多種因素相互作用所致。

茜草藤為茜草的地上部分，以茜草藤為主要成分的中成藥制劑“兒瀉停顆?！庇糜谛簼駸醿?nèi)蘊(yùn)型腹瀉，臨床效果良好[4]。有研究顯示[5-6],茜草藤在UC中具有抗炎的療效。除此之外，SUN等[7]研究顯示茜草藤還具有抗病毒的藥理作用。但是目前茜草藤在DSS誘導(dǎo)UC小鼠模型中是否具有預(yù)防結(jié)腸炎的作用筆者尚未見報(bào)道，因此本課題組實(shí)驗(yàn)研究茜草藤水提物預(yù)防UC的作用。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性 C57BL /6J 小鼠 24 只，6～8 周齡，體質(zhì)量(22±2)g，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2015-0018。飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院動(dòng)物房，動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為 (22±2)℃，相對(duì)濕度為 (50±5)%。

1.2藥物及試劑 茜草藤，2014年9月采于陜西省漢中地區(qū)，經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院張勇慧教授鑒定為茜草的地上部分，標(biāo)本存放于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，編號(hào)為：NP2014100703。葡聚糖硫酸鈉(DSS)相對(duì)分子質(zhì)量為35 000～50 000(美國(guó)MP公司，批號(hào)：160110)。小鼠白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(Elk biotechnology公司，批號(hào)分別為ELK1271，ELK1395，ELK1132)。

1.3儀器 酶標(biāo)儀(Diatek公司，型號(hào)：DR-200Bs)，恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號(hào)：GNP9160)，制冰機(jī)(常熟市雪科電器有限公司，型號(hào)：IMS-20)。

1.4實(shí)驗(yàn)分組 將 24 只 C57BL /6J 小鼠采用體質(zhì)量分層隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，茜草藤大、小劑量組，每組 6 只。

1.5茜草藤水提物的制備 稱取粉碎后的茜草藤 1000 g，加水至沒過藥材，浸泡30 min，煎煮 1 h，將水煎液轉(zhuǎn)移，再加水至沒過藥材，煎煮1 h，合并水煎液，靜置 2 h，依次用脫脂棉、濾紙濾過。將濾過液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮(溫度65 ℃)，將濃縮至約1000 mL的水煎液放置-20 ℃冰箱保存，待用。

1.6造模方法及藥物干預(yù) 茜草藤大、小劑量組分別預(yù)防性灌胃茜草藤提取物4.8，1.2 g·kg-1，預(yù)防性給予3 d，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃等體積純化水；模型對(duì)照組和茜草藤大、小劑量組分別給予3% DSS溶液造模，自由飲用，連續(xù)飲用 7 d，空白對(duì)照組小鼠給予純化水飲用，直到實(shí)驗(yàn)第10天。小鼠灌胃藥物，給藥體積為20 mL·kg-1，每天1次，空白對(duì)照組小鼠給予純化水。

1.7疾病活動(dòng)度評(píng)分 造模前、造模后和給藥后分別觀察小鼠精神及活動(dòng)狀況, 每天記錄小鼠體質(zhì)量變化、大便性狀及便血情況，計(jì)算疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index, DAI)。體質(zhì)量變化 (%)=(造模后體質(zhì)量-造模前體質(zhì)量)/造模前體質(zhì)量×100%。評(píng)分如下，①0分：體質(zhì)量無(wú)變化，大便正常，無(wú)便血；②1分：體質(zhì)量變化1%～5%，便軟，成型，有便血點(diǎn)；③2分：體質(zhì)量變化5%～10%，大便有黏液，成型，成塊便血；④3分：體質(zhì)量變化10%～15%，便軟，有黏液，成型，成片的便血；⑤4分：體質(zhì)量變化15%～20%，便軟，有黏液，不成型，便血及肛門腫脹。

1.8樣本采集 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，眼球取血，以3500 r·min-1離心10 min，取上層血清、分裝，然后放置-80 ℃冰箱備用；剖腹后，摘取小鼠脾臟，測(cè)量脾臟長(zhǎng)度及稱定脾臟質(zhì)量，脾臟指數(shù)=脾臟總質(zhì)量(mg)/小鼠質(zhì)量(g)；剪取距肛門以上2 cm 結(jié)腸，取病變最明顯處結(jié)腸組織于4%多聚甲醛中，留作病理切片及免疫組化，再取結(jié)腸組織若干移至-80℃冰箱備用。

1.9蘇木精-伊紅(HE)染色檢測(cè) 按常規(guī)包埋、切片，厚度為4 μm，進(jìn)行HE染色，高倍顯微鏡下選取視野，根據(jù)潰瘍大小、炎癥浸潤(rùn)和結(jié)構(gòu)損傷程度等進(jìn)行結(jié)腸組織病變損傷程度統(tǒng)計(jì)和比較，組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下，①炎癥反應(yīng)嚴(yán)重程度，0分：無(wú)，1分：輕微的，2分：中等的，3分，嚴(yán)重的；②炎性反應(yīng)范圍，0分：無(wú)，1分：黏膜，2分：黏膜和黏膜下層，3分，透壁的；③隱窩破壞程度，0分：無(wú)，1分：1/3破壞，2分：2/3破壞，3分，隱窩消失伴上皮細(xì)胞出現(xiàn)，4分：隱窩及上皮細(xì)胞均消失[8]。

1.10ELISA 法檢測(cè)小鼠血清中 IL-1β、組織中TNF-α、IFN-γ 含量 取小鼠血清及組織，血清直接用于檢測(cè)。組織按照1：9比例加入0.9%氯化鈉溶液，用電動(dòng)勻漿器進(jìn)行勻漿，然后 8000 r·min-1離心10 min，取上清液蛋白定量后按照TNF-α、IFN-γ ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作并做檢測(cè)。

1.11Toll樣受體(TLR4)，髓樣分化因子88(MYD88)表達(dá) 采用SP法，一抗稀釋濃度分別為兔抗TLR4多克隆抗體1：1000，兔抗MYD88多克隆抗體1：400，二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體1：200。

2 結(jié)果

2.1體質(zhì)量變化 茜草藤對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC小鼠的體質(zhì)量影響見圖1。空白對(duì)照組小鼠在實(shí)驗(yàn)期間體質(zhì)量均上升，一般狀態(tài)良好。小鼠飲用含3%DSS飲用水后，3組小鼠體質(zhì)量均不同程度下降。實(shí)驗(yàn)第7天，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組體質(zhì)量明顯減少(P<0.01)，模型對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)第7～10天體質(zhì)量均下降，且第9和第10天下降最明顯。茜草藤大、小劑量組體質(zhì)量均較模型對(duì)照組偏高，第8天，與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.2DAI評(píng)分 茜草藤對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC小鼠DAI評(píng)分見圖2?？瞻讓?duì)照組小鼠體質(zhì)量有所增加，大便硬度適中，黑褐色，橢圓形，無(wú)稀便及血便，故其DAI評(píng)分主要是其體質(zhì)量波動(dòng)評(píng)分。模型對(duì)照組小鼠飲用3%DSS 4 d后，大便性狀開始變化，先是成形大便，然后逐漸變?yōu)橄∷纱蟊?，甚至是水樣瀉，第5天部分小鼠出現(xiàn)血便，DAI評(píng)分顯著升高；茜草藤大、小劑量組小鼠在造模后也出現(xiàn)體質(zhì)量降低、大便性狀改變，以及腹瀉、血便等癥狀，但癥狀明顯比模型對(duì)照組輕。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠在第5天DAI評(píng)分均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，茜草藤大、小劑量組DAI評(píng)分也升高，但造模后DAI評(píng)分均低于模型對(duì)照組，第6天DAI評(píng)分顯著低于模型對(duì)照組(P<0.05)。

與空白對(duì)照組比較，*1P<0.01；與模型對(duì)照組比較，*2P<0.05。

與空白對(duì)照組比較，*1P<0.01；與模型對(duì)照組比較，*2P<0.05 。

2.3茜草藤水提物對(duì)小鼠結(jié)腸病理組織學(xué)的影響 小鼠結(jié)腸HE染色病理組織學(xué)變化見圖3，4?？瞻讓?duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞形態(tài)正常，固有膜內(nèi)未見明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)；與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠可見結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞大量脫落形成潰瘍，黏液分泌增加，固有膜充血水腫，伴大量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，呈潰瘍性炎癥改變，病理學(xué)評(píng)分顯著升高(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，茜草藤大、小劑量組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)較完整且黏膜層細(xì)胞未脫落，黏膜上皮細(xì)胞僅見少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，病理學(xué)評(píng)分均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

A.空白對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.茜草藤大劑量組；D.茜草藤小劑量組。

2.4茜草藤水提物對(duì)血清炎癥因子IL-1β 及結(jié)腸組織炎性因子TNF-α、IFN-γ 的影響 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組血清中IL-1β、結(jié)腸組織中TNF-α 含量顯著上升(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，茜草藤大、小劑量組血清IL-1β、組織TNF-α 含量顯著降低(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，空白對(duì)照組，茜草藤大、小劑量組組織中IFN-γ 水平均降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5。

A.空白對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.茜草藤大劑量組；D.茜草藤小劑量組；與空白對(duì)照組比較, *1P<0.01；與模型對(duì)照組比較，*2P<0.01。

2.5茜草藤水提物對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織中 TLR4、MYD88表達(dá)的影響 空白對(duì)照組中TLR4結(jié)腸上皮及細(xì)胞質(zhì)中可見較多藍(lán)色細(xì)胞核，少量呈陽(yáng)性表達(dá)的棕黃色；模型對(duì)照組中TLR4分布于結(jié)腸上皮及膜內(nèi)側(cè)細(xì)胞質(zhì)中，可見較多呈強(qiáng)陽(yáng)性的深棕色顏色；與模型對(duì)照組比較，茜草藤大、小劑量組TLR4表達(dá)降低。MYD88在空白對(duì)照組、模型對(duì)照組中呈低表達(dá)；與模型對(duì)照組比較，茜草藤大、小劑量組結(jié)腸黏膜及上皮細(xì)胞中呈深黃色陽(yáng)性高表達(dá)，見圖6,7。

3 討論

UC是目前重點(diǎn)研究的一種慢性疾病，UC模型的建立是研究生理病理工作的第一步，目前常用于UC基礎(chǔ)藥物研究的造模方法為化學(xué)誘導(dǎo)法，其中DSS誘導(dǎo)的模型是最廣泛使用的模型[8-10]。因此本課題組選擇DSS誘導(dǎo)UC模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，以評(píng)價(jià)茜草藤水提物對(duì)UC的預(yù)防作用。

現(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為TLR4/MYD88依賴途徑在炎癥反應(yīng)中扮演重要角色，細(xì)菌釋放的脂多糖激活TLR4，激活后的TLR4可與MYD88、TIRAP/MAL等信號(hào)途徑傳導(dǎo)，啟動(dòng)下游信號(hào)通路進(jìn)而激活NF-κB，引起炎癥遞質(zhì)IL-1β、TNF-α、IFN-γ 等大量釋放，促進(jìn)結(jié)腸黏膜的損傷。本課題組選擇MYD88依賴性信號(hào)通路，以TLR4、MYD88、IL-1β、TNF-α、IFN-γ作為觀察指標(biāo)，通過ELISA檢測(cè)IL-1β、TNF-α、IFN-γ 的表達(dá)水平，免疫組織化學(xué)檢測(cè)TLR4、MYD88的表達(dá)。

本研究通過小鼠體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在實(shí)驗(yàn)前3 d預(yù)防性給藥期間，茜草藤大劑量組小鼠體質(zhì)量下降比模型對(duì)照組更明顯，在實(shí)驗(yàn)第6天后上升，但沒有茜草藤小劑量組上升幅度明顯，DAI評(píng)分也顯示相同的趨勢(shì)，茜草藤大劑量組在實(shí)驗(yàn)前3 dDAI評(píng)分升高，之后緩慢下降，可能是因?yàn)榇髣┝寇绮萏賹?duì)腸道具有刺激作用，使小鼠體質(zhì)量下降，故而DAI評(píng)分也升高。在實(shí)驗(yàn)第4天給予小鼠3%DSS溶液以誘導(dǎo)UC模型，小鼠在飲用DSS后，體質(zhì)量均不同程度地下降，出現(xiàn)明顯的腹瀉、血便情況，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組DAI評(píng)分顯著升高。而預(yù)防性給予茜草藤水提物后，各組小鼠體質(zhì)量、腹瀉、血便癥狀明顯改善，其DAI評(píng)分顯著低于模型對(duì)照組。HE染色病理切片結(jié)果顯示與空白對(duì)照組比較模型對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)不完整，伴有上皮細(xì)胞大量脫落形成潰瘍；與模型對(duì)照組比較茜草藤大、小劑量組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)較完整，病理?yè)p傷有所改善。本研究并不是考察抗炎細(xì)胞因子與促炎細(xì)胞因子的失衡導(dǎo)致UC，所以只檢測(cè)促炎細(xì)胞因子的水平，并未檢測(cè)抗炎細(xì)胞因子的水平。ELISA結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組比較，茜草藤大、小劑量組血清中促炎細(xì)胞因子IL-1β、組織中TNF-α 水平均顯著降低；與模型對(duì)照組比較，茜草藤大、小劑量組組織中 IFN-γ 水平均降低，無(wú)顯著性差異。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示與模型對(duì)照組比較，茜草藤大、小劑量組MYD88的陽(yáng)性表達(dá)較高，推測(cè)其炎癥可能并不是通過TLR4/MYD88信號(hào)通路傳導(dǎo)。

A.空白對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.茜草藤大劑量組；D.茜草藤小劑量組；與空白對(duì)照組比較, *1P<0.05；與模型對(duì)照組比較，*2P<0.05。

A.空白對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.茜草藤大劑量組；D.茜草藤小劑量組。

A.空白對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.茜草藤大劑量組；D.茜草藤小劑量組。