酶解法制備玉米蛋白抗氧化肽的工藝研究

姬晨曦，杜晶芳，王詩馨，安 南，趙穎清，于亞莉

（吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程系，吉林長春 130062）

我國已有470多年的玉米栽培歷史，除了小麥和水稻，玉米在糧食作物中居于第3位，目前我國的玉米種植量僅次于美國。玉米中所含營養(yǎng)素較為全面，玉米蛋白的制備和應(yīng)用獲得了廣泛良好的來源。玉米蛋白粉是玉米淀粉在濕法加工中的副產(chǎn)物，其蛋白質(zhì)含量達(dá)到50%以上，由于水溶性差、氨基酸不平衡，口感粗糙，所以在食品工業(yè)中的應(yīng)用受到很大地限制[1-3]。故而絕大部分玉米蛋白并未物盡其用，造成了較大的浪費(fèi)。玉米抗氧化肽的開發(fā)為玉米蛋白粉的深加工提供了契機(jī)。隨著保健食品市場(chǎng)的擴(kuò)展，開發(fā)玉米新型功能肽對(duì)于提高人類健康水平和促進(jìn)食品工業(yè)發(fā)展具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。

近年來，玉米淀粉加工副產(chǎn)物已得到學(xué)術(shù)界的認(rèn)可，逐漸將這些副產(chǎn)物進(jìn)行綜合利用，開發(fā)其潛在價(jià)值。已有人將玉米漿回收以制取抗生素、酶制劑、味精、蛋白飼料粉，做成發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基，并提取菲酊，制備植酸和肌醇[4-6]；而玉米胚芽則成為磷脂的良好提取源，胚芽蛋白精制后用作餅干點(diǎn)心的蛋白添加劑等[7]；玉米蛋白粉則已用于提取玉米黃素，制備谷氨酸、生產(chǎn)醇溶蛋白等。玉米蛋白特殊的氨基酸組成和序列使其肽鏈中存在著不同的功能區(qū)，具有抗氧化等多肽功能[3，8-9]。利用玉米蛋白此特點(diǎn)已制備出具有各種生物功能的活性肽[3，10-11]。但針對(duì)于該研究還是相對(duì)較少，因而，玉米功能活性肽的研究與開發(fā)成為科研熱點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米蛋白粉，陜西森弗天然制品有限公司提供。

1.2 試劑

堿性蛋白酶，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；胰蛋白酶，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；PBS，上海立菲生物技術(shù)有限公司提供；ABTS，NaOH，HCl和過硫酸鉀等，以上均為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

XMTD-8222型水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；JJ-1型精密定時(shí)電動(dòng)攪拌器，金壇市榮華儀器制造有限公司產(chǎn)品；Starter2C型pH計(jì)，奧豪斯儀器（上海） 有限公司產(chǎn)品；ME203E型電子天平，METTLERTOLTDO產(chǎn)品；CR20B2型高速冷凍離心機(jī)，日立公司產(chǎn)品；SCIENTZ-ⅡD型超聲波細(xì)胞破碎儀，新芝公司產(chǎn)品；SynergyHT型酶標(biāo)儀，BioTek公司產(chǎn)品；DG-800型漩渦混合器，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；MH-2型微量振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 玉米蛋白肽的制備

玉米蛋白粉過80目篩→配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的玉米蛋白粉溶液→攪拌均勻→超聲功率500 W，時(shí)間10 min→在90℃下變性10 min→冷卻至適宜溫度→1 mol/L NaOH或HCl溶液調(diào)pH值至合適→同時(shí)加入10%堿性蛋白酶和定量胰蛋白酶→酶解→90℃下滅酶10 min→以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心10 min。

1.4.2 蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定

pH-stat法[12]（當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)酶解過程中在pH值＞6.5時(shí)）。

式中：DH——蛋白質(zhì)水解度，%；

V——水解過程中用去NaOH的量，mL；

M——蛋白粉質(zhì)量，g；

η——蛋白粉中蛋白質(zhì)含量，%；

C——NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；

1.01 ——氨基酸的平均解離度，%；

8.38 ——每克蛋白質(zhì)中肽鍵的克當(dāng)量，mol/L。

1.4.3 玉米蛋白肽抗氧化活性的影響

ABTS·清除率測(cè)定方法[13]。用蒸餾水配制7 mmol/L的ABTS溶液，將ABTS溶液和過硫酸鉀溶液（終濃度為2.45 mmol/L）按1∶1的體積比混合，配制得到ABTS儲(chǔ)備液，并在室溫條件下避光靜置12～16 h后，用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH值7.4）將儲(chǔ)備液稀釋一定倍數(shù)（20～30倍），使其在波長734 nm處吸光度為0.7±0.02，形成ABTS工作液。用移液槍吸取180 μL的ABTS工作液至96孔板各孔中，然后每孔加入20 μL樣品溶液，振蕩10 s后，測(cè)定反應(yīng)體系于波長734 nm處的吸光度。ABTS工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。

試驗(yàn)分為3組：①空白組：每孔加200 μL PBS溶液；②對(duì)照組：180 μL ABTS工作液加20 μL PBS溶液；③試驗(yàn)組：180 μL ABTS工作液加20 μL樣品溶液（稀釋20倍）。每個(gè)樣品濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，取平均值。ABTS+·清除率計(jì)算公式如下：

式中：X——ABTS自由基清除率，%；

As——試驗(yàn)組；

AC——對(duì)照組；

AB——空白組。

1.4.4 玉米蛋白酶解條件的確定

（1） 單因素試驗(yàn)?？刂泼附饷傅妆龋?%，6%，8%，10%，12%）、酶解pH值（7，8，9，10，11，12）、酶解溫度 （45，50，55，60，65 ℃）、酶解時(shí)間（1，2，3，4，5 h） 其中的3個(gè)因素為定量，研究其中一個(gè)因素對(duì)制備玉米蛋白抗氧化肽的影響。

（2）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。在此前單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以ABTS·清除率和玉米蛋白水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)。確定正交試驗(yàn)的4個(gè)因素及3個(gè)水平進(jìn)一步優(yōu)化玉米蛋白酶解的工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶水解條件單因素試驗(yàn)

2.1.1 [E]/[S]對(duì)玉米蛋白水解度和水解液抗氧化活性的影響

胰蛋白酶[E]/[S]依次為4%，6%，8%，10%，12%時(shí)，酶解溫度55℃，pH值9.0，酶解4h后，以玉米蛋白抗氧化肽的ABTS·清除率為主要衡量指標(biāo)，玉米蛋白水解度為輔助性指標(biāo)，分別測(cè)得二者隨[E]/[S]變化的趨勢(shì)。

[E]/[S]與玉米抗氧化肽水解度和自由基清除率的關(guān)系見圖1。

圖1 [E]/[S]與玉米抗氧化肽水解度和自由基清除率的關(guān)系

從圖1可以看出，隨著[E]/[S]的變化，玉米蛋白的水解度在胰蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%～8%時(shí)，水解度變化明顯，呈直線型，與水解速率基本成正比變化；而達(dá)到10%時(shí)水解速率明顯下降；當(dāng)達(dá)到12%時(shí)，水解度雖然有所增加，但是變化趨勢(shì)已經(jīng)趨于平緩。究其原因可能是底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和數(shù)量有限，從而限制了堿性蛋白酶和胰蛋白酶與底物的結(jié)合，導(dǎo)致水解度不會(huì)無限升高，后期變化趨勢(shì)不明顯并趨于平緩。

在[E]/[S]逐漸增加的情況下，制備所得玉米蛋白抗氧化肽活性逐漸上升，當(dāng)[E]/[S]達(dá)到8%時(shí)，其抗氧化活性最大；當(dāng)[E]/[S]＞8%時(shí)，玉米蛋白抗氧化肽ABTS·清除活性反而下降。當(dāng)胰蛋白酶添加少量或者適量時(shí)，玉米蛋白底物能夠與酶充分結(jié)合，水解產(chǎn)生的活性短肽逐漸增加，以至于粗提液的抗氧化活性增強(qiáng)；但蛋白酶添加過量時(shí)，會(huì)使已產(chǎn)生的多肽過度水解，得到分子量更小的肽段或游離氨基酸，導(dǎo)致具有較高自由基清除能力的多肽含量降低，使自由基清除能力降低[14]。

2.1.2 pH值對(duì)玉米蛋白水解度和水解液抗氧化活性的影響

胰蛋白酶[E]/[S]為8%，酶解溫度55℃，酶解時(shí)間4 h，pH值依次變化時(shí)，以玉米蛋白抗氧化肽的ABTS·清除率為主要衡量指標(biāo)，玉米蛋白水解度為輔助性指標(biāo)，二者的變化情況。

pH值與玉米抗氧化肽水解度和自由基清除率的關(guān)系見圖2。

圖2 pH值與玉米抗氧化肽水解度和自由基清除率的關(guān)系

從圖2可以看出，隨著pH值的增加，玉米蛋白水解度處于上升趨勢(shì)，在pH值為11時(shí)，水解度達(dá)到最大，pH值再次增加時(shí)，水解度漸次下降。水解度與蛋白酶的最適pH值息息相關(guān)。試驗(yàn)中使用了堿性蛋白酶和胰蛋白酶2種酶進(jìn)行水解。而試驗(yàn)用堿性蛋白酶的最佳pH值處于9～12，胰蛋白酶則位于8～10。只有pH值處于合適的范圍內(nèi)，蛋白酶才能最大程度的發(fā)揮作用。前期當(dāng)pH值處于7～10時(shí)，發(fā)揮水解作用的主要是胰蛋白酶，堿性蛋白酶效力較弱；當(dāng)pH＞10時(shí)，堿性蛋白酶成為主要發(fā)揮作用的酶，而胰蛋白酶則由于所處環(huán)境過堿性，所以活力減弱，或許正是兩者強(qiáng)弱配合使得玉米蛋白水解度在pH值為11時(shí)達(dá)到最大；當(dāng)pH＞11時(shí)，pH值環(huán)境已然超過堿性蛋白酶和胰蛋白酶的最適范圍，引起酶分子內(nèi)部構(gòu)象的改變即蛋白酶的部分變性，使得酶與底物不能有效結(jié)合，進(jìn)一步導(dǎo)致水解度降低。而玉米蛋白水解液的抗氧化活性最初隨著pH值的上升而增強(qiáng)，當(dāng)pH值9.0時(shí)，玉米蛋白水解液的抗氧化活性達(dá)到最高；而pH＞9.0后，水解液的ABTS自由基清除活性急速下降?？寡趸钚缘慕档涂赡苁怯蓛刹糠衷蛞穑哼^堿的環(huán)境致使酶結(jié)構(gòu)被破壞，堿性蛋白酶和胰蛋白酶水解玉米蛋白產(chǎn)生的抗氧化活性肽濃度較低；另一方面，雖然過堿環(huán)境破壞了部分酶結(jié)構(gòu)，足夠的時(shí)間內(nèi)玉米蛋白仍然水解完全，但是強(qiáng)堿性環(huán)境對(duì)產(chǎn)生的玉米蛋白抗氧化肽的理化結(jié)構(gòu)造成損傷，使其抗氧化活性降低，從而造成水解液抗氧化活性降低。

2.1.3 酶解溫度對(duì)玉米蛋白水解度和水解液抗氧化活性的影響

胰蛋白酶[E]/[S]為8%，pH值9.0，酶解時(shí)間4 h后，以玉米蛋白抗氧化肽的ABTS·清除率為主要衡量指標(biāo)，玉米蛋白水解度為輔助性指標(biāo)，二者隨酶解溫度變化的情況。

酶解溫度與玉米抗氧化肽水解度和自由基清除率的關(guān)系見圖3。

圖3 酶解溫度與玉米抗氧化肽水解度和自由基清除率的關(guān)系

從圖3可以看出，玉米蛋白水解度隨著酶解溫度上升而上升；當(dāng)酶解溫度達(dá)到55℃時(shí)，水解度最大；此后溫度繼續(xù)上升時(shí)，水解度則有較大幅度的下降。堿性蛋白酶和胰蛋白酶最適作用溫度分別為55～70℃和40～60℃。酶解溫度低于55℃時(shí)，堿性蛋白酶和胰蛋白酶的作用環(huán)境并未達(dá)到最適，相同水解時(shí)間內(nèi)，玉米蛋白水解程度并不完全；而當(dāng)酶解溫度高于55℃時(shí)，胰蛋白酶結(jié)構(gòu)已經(jīng)不再穩(wěn)定，酶活性降低，玉米蛋白水解度降低。

玉米蛋白抗氧化肽的抗氧化活性開始時(shí)隨著酶解溫度升高而升高，當(dāng)酶解溫度達(dá)到55℃時(shí)，水解液的抗氧化活性最高，酶解溫度高于55℃時(shí)，水解液的抗氧化活性漸漸下降。酶解溫度過高時(shí)，酶結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，酶活性降低，對(duì)玉米蛋白抗氧化肽的產(chǎn)生有不良影響。另一可能情況則是酶解溫度過高時(shí)，蛋白酶活性降低，雖然產(chǎn)生了足夠數(shù)量的玉米蛋白抗氧化肽，但高溫使得玉米蛋白抗氧化肽的結(jié)構(gòu)改變，ABTS·清除活性降低。

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)玉米蛋白水解度和水解液抗氧化活性的影響

胰蛋白酶[E]/[S]為8%，酶解溫度55℃，pH值9.0，以玉米蛋白抗氧化肽的ABTS自由基清除率為主要衡量指標(biāo)，玉米蛋白水解度為輔助性指標(biāo)，二者隨酶解時(shí)間的變化。

酶解時(shí)間與玉米抗氧化肽水解度和自由基清除率的關(guān)系見圖4。

圖4 酶解時(shí)間與玉米抗氧化肽水解度和自由基清除率的關(guān)系

從圖4可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長，玉米蛋白水解度漸次上升，酶解時(shí)間達(dá)到4 h時(shí)，水解度達(dá)到最大，時(shí)間繼續(xù)延長并不能使水解度繼續(xù)上升，并且在誤差范圍內(nèi)略有下降。隨著酶解時(shí)間的延長，玉米蛋白分子結(jié)構(gòu)較大程度改變，酶切位點(diǎn)暴露全面，水解度上升，但玉米蛋白底物含量有限，經(jīng)過4 h后，酶解完全，時(shí)間繼續(xù)延長并不能使水解度繼續(xù)增加，因此保持平緩狀態(tài)。

隨著酶解時(shí)間的延長，ABTS·清除率顯著增加。酶解時(shí)間為2 h時(shí)，ABTS·清除率最高，時(shí)間繼續(xù)延長反而使得ABTS·清除率下降。出現(xiàn)這樣的反應(yīng)趨勢(shì)是由于反應(yīng)時(shí)間過長，堿性蛋白酶和胰蛋白酶促使玉米蛋白過度水解，產(chǎn)生分子量更小的肽甚至是游離氨基酸，使得具有自由基清除能力的多肽被破壞，影響了玉米蛋白抗氧化肽的活性[15]。另一方面可能是由于酶解時(shí)間過長，玉米蛋白酶解產(chǎn)生的有效抗氧化活性肽過度酶解，導(dǎo)致其ABTS·清除活性下降。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在此前單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以ABTS·清除率為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)。通過正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化玉米蛋白酶解的工藝條件。

L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果分析見表2。

從表2可以看出，方案設(shè)計(jì)中影響玉米蛋白水解度的主次順序?yàn)镈＞C＞B=A。極差分析顯示，pH值是影響玉米蛋白水解度的關(guān)鍵因素。水解度優(yōu)化的綜合選擇為A2B1C3D3，即[E]/[S]為8%，酶解時(shí)間2 h，酶解溫度60℃，pH值9.0。酶解條件按此組合可獲得玉米蛋白的最大水解度。根據(jù)表2～表5的方差分析發(fā)現(xiàn)pH值對(duì)水解度的影響極為顯著，溫度影響次之。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

對(duì)抗氧化活性而言，胰蛋白酶[E]/[S]、酶解溫度、pH值和酶解時(shí)間4個(gè)因素中影響玉米蛋白抗氧化肽清除ABTS·的主次順序?yàn)镃＞D＞B＞A。從極差分析中可以看出溫度是酶解過程中影響玉米蛋白抗氧化肽ABTS·清除率的最主要因素，pH值次之，[E]/[S]的影響最小。各方面綜合考慮，最終優(yōu)選制備玉米蛋白抗氧化肽的最佳工藝條件為A1B1C3D3，即[E]/[S]6%，酶解時(shí)間2 h，酶解溫度60℃，pH值9.0。工藝條件如此組合時(shí)，玉米蛋白抗氧化肽可以獲得最高的ABTS·清除率。依據(jù)表4可得，酶解溫度和pH值對(duì)玉米蛋白抗氧化肽的ABTS·清除率影響十分顯著，時(shí)間影響相對(duì)較弱，[E]/[S]的影響則可以記為試驗(yàn)的誤差列。

水解度的方差分析見表3，ABTS·清除率方差分析見表4。

綜合考慮玉米蛋白水解度和水解液的抗氧化活性，可能因?yàn)樵囼?yàn)過程中采用堿性蛋白酶和胰蛋白酶共同控制水解，水解度和ABTS·清除率之間無必然的因果聯(lián)系。而試驗(yàn)主要以玉米蛋白抗氧化肽的ABTS·清除率為主要指標(biāo)，因此，采用A1B1C3D3組合作為最終的制備工藝條件，以期能夠同時(shí)獲得較好的水解度和良好的玉米蛋白抗氧化肽。

表3 水解度的方差分析

表4 ABTS·清除率方差分析

3 結(jié)論

以玉米蛋白水解度和水解液的ABTS·清除率為檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)堿性蛋白酶配合胰蛋白酶水解玉米蛋白的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。在堿性蛋白酶用量固定的情況下，玉米蛋白水解的最適條件為酶解溫度60℃，pH值9.0，胰蛋白酶[E]/[S]6%，酶解時(shí)間2 h。經(jīng)過驗(yàn)證試驗(yàn)證明，在此條件下，玉米蛋白水解度為20.42%，水解液ABTS·清除率為90.06%±0.7%。與單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)各組試驗(yàn)條件所得結(jié)果相比，經(jīng)過正交試驗(yàn)優(yōu)化篩選的試驗(yàn)條件能夠同時(shí)獲得令人滿意的水解度和ABTS自由基清除率，并且試驗(yàn)結(jié)果更加穩(wěn)定。