榆芩顆粒提取工藝的優(yōu)選研究

向梅先，黃玉瑩，甘大莉，范亞

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢430074)

炎癥是常見多發(fā)性病癥，是活體組織對炎性因子產(chǎn)生的以預(yù)防為主的反應(yīng)，臨床表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛及功能障礙，并伴有發(fā)熱、白細(xì)胞增加、單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)增生等全身反應(yīng)，是由炎癥介質(zhì)分子和/或細(xì)胞因子介導(dǎo)的一個過程[1].研究表明炎癥與中風(fēng)、偏頭疼、癌癥、骨關(guān)節(jié)炎、哮喘、老年性癡呆、動脈硬化、心臟病、牙周炎、慢性疲勞綜合征等有關(guān)[2-4].

中藥對感染性疾病、炎癥等具有較好療效，中藥復(fù)方配伍可產(chǎn)生協(xié)同作用，還能增強(qiáng)患者免疫力；且中藥具有毒副作用小，不易產(chǎn)生耐藥性，可持續(xù)服用等優(yōu)勢[5].目前市面上療效較好的中藥抗炎藥主要有：蒲地藍(lán)消炎片、消炎片(蒲公英、紫花地丁、野菊花、黃芩)、雙黃消炎片、炎立消膠囊、穿王消炎膠囊等，但這些藥雖具備較好的抗炎作用，卻普遍不同時(shí)具有抗菌、消炎等作用.

中藥復(fù)方顆粒[6]是以符合炮制規(guī)則的標(biāo)準(zhǔn)飲片為原料，經(jīng)過提取、濃縮、干燥、制粒等步驟制備成的產(chǎn)品[7]，既保持了中藥復(fù)方多靶點(diǎn)，多活性，也保持了顆粒劑的基本優(yōu)點(diǎn)，比如可分散或溶解在水或其他適宜的液體中服用.純中藥制劑榆芩顆粒是三甲醫(yī)院制劑，臨床使用多年，具有較好的抗菌和消炎作用，主要用于痢疾，上呼吸道感染，扁桃體炎、尿路感染等疾病.該顆粒由地榆[8]、黃芩[9]、石榴皮[10,11]等中藥組成.地榆具有涼血止血、解毒斂瘡的功效，在止血、抗炎消腫、抗菌等方面發(fā)揮著重要的作用[12]；黃芩清熱燥濕，瀉火解毒，止血，亦可抗菌，在臨床上廣泛應(yīng)用于治療上呼吸道感染、肺炎及肺熱引起的咳嗽[13]；石榴皮具有生津止渴、止瀉止血等功效，具有抗氧化、清除自由基、保護(hù)消化系統(tǒng)等藥理作用[14].

雖然榆芩顆粒具備較好的療效與較小副作用，但作為醫(yī)院制劑，存在提取工藝粗糙，制量標(biāo)準(zhǔn)不完善，使用范圍小等不足之處.如該藥現(xiàn)階段質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢查這一項(xiàng)基本處于空白，而根據(jù)2015年版藥典規(guī)定，復(fù)方制劑需使用高效液相色譜法測定其有效成分.此外，該制劑存在處方中藥材的提取工藝未經(jīng)過正交實(shí)驗(yàn)來優(yōu)選[15-17]，有效成分是否被提取完全也不能確定[18,19]等問題.針對該制劑提取工藝上存在的問題，本文擬對提取工藝進(jìn)行優(yōu)選研究.

1 材料、試劑和儀器

高效液相色譜儀(Untimate3000，美國戴安公司)，分析天平(CP214，奧豪斯公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52AA，上海亞榮)，循環(huán)水式真空泵(2XZ-1，上海雙鶴)，真空干燥箱(DZF-6090，天津泰斯特儀器).

沒食子酸(批號110831)、鞣花酸(批號111959)、黃芩苷(批號110747)購于中國食品藥品檢定研究院；藥材石榴皮(批號2016001)、黃芩(批號20160702)、地榆(批號20160901)購于湖北天濟(jì)飲片藥業(yè)；石榴皮為石榴科植物石榴PunicagranatumL.的干燥果皮，地榆為薔薇科植物地榆SanguisorbaofficinalisL的干燥根、黃芩為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，以上3種中藥材均由中南民族大學(xué)藥學(xué)院萬定榮老師鑒定；甲醛、乙腈為色譜純(Sigma)，其他試劑均為分析純.

2 方法

2.1 指標(biāo)成分含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱Agela Venusil MP-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫保持30 ℃，流動相A相：乙腈；流動相D相：體積分?jǐn)?shù)為0.2%的磷酸緩沖鹽溶液，檢測波長270 nm.采用梯度洗脫，調(diào)整流動相D相(磷酸緩沖鹽溶液)的體積百分?jǐn)?shù)，其方案如下：0～15 min，96% D；15～18 min，96%～81% D；18～34 min，81% D；34～36 min，81%～70%D；36～50 min，70%D.

2.1.2 對照品溶液的配置

稱取黃芩苷、鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg、15.0 mg于10 mL容量瓶中，加入色譜級甲醇溶解并定容，得濃度為2.0 mg·mL-1的黃芩苷和1.5 mg·mL-1的鞣花酸對照品溶液；稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg分別置于10 mL容量瓶中，加入蒸餾水溶解并定容，即得濃度為0.5 mg·mL-1的沒食子酸對照品溶液.

2.1.3 樣品溶液的配制

稱取0.1 g的各組樣品，放置在10 mL的容量瓶中，加入少量色譜級甲醇溶解，超聲2 h，取出，放置冷卻至室溫，過濾，加入色譜級甲醇稀釋，定容.

2.1.4 黃芩苷、沒食子酸、鞣花酸對照品線性關(guān)系的考察

精密量取黃芩苷、沒食子酸、鞣花酸對照品溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL于10 mL容量瓶中稀釋得到系列濃度.黃芩苷濃度為: 0.080、0.144、0.208、0.272、0.336、0.400 mg·mL-1; 沒食子酸為: 0.020、0.036、0.052、0.068、0.084、0.100 mg·mL-1;鞣花酸為: 0.060、0.108、0.156、0.204、0.252、0.300 mg·mL-1.混合對照品溶液，以0.45 μm的有機(jī)系微孔濾膜過濾，進(jìn)樣10 μL至高效液相色譜儀中.按上述色譜條件測量3種有效成分的峰面積，以沒食子酸對照品、黃芩苷對照品、鞣花酸對照品溶液的濃度(C，mg·mL-1)作為橫坐標(biāo)，峰面積(A)作為縱坐標(biāo)制備各標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線.

2.1.5 方法學(xué)驗(yàn)證

1)專屬性實(shí)驗(yàn)

分別取上述制備好的樣品以及對照品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)行測定.

2)精密度實(shí)驗(yàn)

配制30、60、90 μg·mL-1的沒食子酸溶液；180、360、540 μg·mL-1的黃芩苷溶液；60、120、180 μg·mL-1的鞣花酸溶液.微孔濾膜過濾后分別進(jìn)樣10 μL至高效液相色譜儀中，測定其峰面積(A)，1 d內(nèi)測定3次，連續(xù)測定3 d，觀察結(jié)果，計(jì)算RSD值，以考察儀器的精密性.

3)樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按“2.1.3”方法配制樣品溶液，進(jìn)樣至高效液相色譜儀中，連續(xù)進(jìn)樣6針，測定峰面積計(jì)算沒食子酸、鞣花酸和黃芩苷含量，計(jì)算RSD值，考察色譜條件是否可以重復(fù).

4)樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按“2.1.3”方法配制成樣品溶液，按照色譜條件進(jìn)樣至高效液相色譜儀中，在0、12、24、36、48 h時(shí)分別進(jìn)樣一次，計(jì)算沒食子酸、鞣花酸和黃芩苷含量，計(jì)算RSD值，考察儀器日內(nèi)和日間的穩(wěn)定性.

5)加樣回收率試驗(yàn)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中沒食子酸、鞣花酸和黃芩苷的含量，再分別加入相當(dāng)于樣品溶液含量80%、100%、120%的標(biāo)準(zhǔn)品，同樣品處理，測定其含量并計(jì)算RSD值.

2.1.6 浸膏得率的測定

對石榴皮、黃芩和地榆等藥材按照因素水平表的方法進(jìn)行提取，將所得濾液過濾，回收合并后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至稠膏.水浴鍋上揮干水分后在真空干燥箱中干燥至恒重，溫度設(shè)置為60 ℃，根據(jù)以下公式計(jì)算收率：

干浸膏率=(干浸膏重量/藥材總重)×100%

2.2 正交實(shí)驗(yàn)工藝優(yōu)化

2.2.1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

以藥材粒度(A)、乙醇濃度(B)、加醇量(C)和提取時(shí)間(D)為考察因素，對干浸膏收率、沒食子酸、鞣花酸和黃芩苷含量為考察指標(biāo)。每因素設(shè)置3個水平，采用L9(34)正交試驗(yàn)對榆芩顆粒的醇提工藝進(jìn)行優(yōu)選.實(shí)驗(yàn)因素水平如表1所示.

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

2.3 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

按最佳提取工藝進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，分別測量其沒食子酸、鞣花酸和黃芩苷含量以及干浸膏收率，以驗(yàn)證優(yōu)選的方法是否為最佳工藝.

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

3.1.1 線性關(guān)系考察結(jié)果

黃芩苷、沒食子酸、鞣花酸線性關(guān)系見表2，線性關(guān)系良好.

表2 線性關(guān)系

3.1.2 專屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖1所示，沒食子酸、鞣花酸和黃芩苷能達(dá)到很好的基線分離，且峰形良好；供試品中3種成分也能與其他組分能達(dá)到基線分離，分離度高于1.5，理論塔板均高于5000.且在同一色譜條件下供試品溶液與標(biāo)準(zhǔn)品峰色譜峰保留時(shí)間一致，表明該色譜條件專屬性好.

a)供試品溶液，b)對照品；1)沒食子酸；2)鞣花酸；3)黃芩苷

3.1.3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，沒食子酸、鞣花酸和黃芩苷在不同濃度下其RSD%均小于2%，說明該儀器精密度良好(表3).

3.1.4 樣品重復(fù)性和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)測得的峰面積實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算RSD%，結(jié)果分別為0.31%、0.28%、0.09%(表4)，均小于2%，說明該儀器用于測定樣品含量時(shí)，結(jié)果穩(wěn)定且可信性度大.穩(wěn)定性結(jié)果分別為3.3%、0.71%，1.20%(表4)，說明在2 d內(nèi)樣品溶液穩(wěn)定性良好.

3.1.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)峰面積和回歸方程求相應(yīng)濃度，結(jié)果見表5，這3者平均回收率均在100%±5%之間，RSD%均小于5%，表明該法可以用于測定沒食子酸、鞣花酸和黃芩苷的含量.

表4 樣品重復(fù)性以及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

3.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)正交因素表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所得樣品分別計(jì)算干浸膏收率，液相色譜法檢測各指標(biāo)含量.結(jié)果及方差分析結(jié)果如表6、7所示：(1)影響干膏收率的主次因素為C>A>D>B，藥材粒度(A)、加醇量(C)對其有顯著性影響(P<0.05)，最佳醇提工藝為A2B1C3D2；(2)影響沒食子酸含量的主次因素為C>A>B>D，藥材粒度(A)、醇濃度(B)、加醇量(C)對其有顯著性影響(P<0.05)，最佳醇提工藝A3B3C1D1；(3)影響鞣花酸含量的主次因素為B>D>A>C，4個因素均對其無顯著性差異(P>0.05)，最佳醇提工藝為A3B3C1D1；(4)影響黃芩苷含量的主次因素為D>C>A>B，加醇量(C)、醇提時(shí)間(D)對其有顯著性影響(P<0.05))，最佳醇提工藝為A3B2C1D1.

從節(jié)約成本和時(shí)間的角度考慮，藥材粒度選擇A3，醇濃度為B3，加醇量為C1，醇提時(shí)間為D1.也就是最佳提取工藝為A3B3C1D1，即石榴皮單提，將藥材粉碎為粗粉，第一次6倍量60%乙醇提取15 min，第二次4倍量60%乙醇提取10 min；其他藥材的最佳提取工藝為將藥材粉碎為粗粉，第一次6倍量60%乙醇提取1 h，第二次4倍量60%乙醇提取0.5 h，合并所有提取液后進(jìn)行減壓濃縮，干燥得浸膏.

3.3 最佳工藝驗(yàn)證

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表8，干膏收率為37.4%，沒食子酸、鞣花酸和黃芩苷含量分別為4.6、18.5、35.4 mg·g-1，與正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，表明該工藝條件較為穩(wěn)定，重復(fù)性良好.因此確定榆芩顆粒的最佳提取工藝為：藥材粉碎為粗粉，乙醇濃度60%，提取2次，第一次6倍量乙醇、第二次4倍量乙醇，且石榴皮單獨(dú)提取，第一次提取15 min、第二次提取10 min，剩余藥材第一次1 h，第二次提取0.5 h，合并濾液，然后減壓濃縮并干燥至衡重.

表8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)語

采用四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)對榆芩顆粒的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)選研究，并確定了最佳提取工藝.石榴皮主要成分為鞣質(zhì)，是水溶性多元酚類化合物，能與蛋白質(zhì)發(fā)生特征性反應(yīng)，不宜長時(shí)間加熱，實(shí)驗(yàn)證明石榴皮加熱30 min以上，其有效含量無明顯變化，所以從節(jié)能和省時(shí)考慮，石榴皮提取時(shí)間為15 min,因此石榴皮與其他藥材分開提取.

以干浸膏收率、沒食子酸、鞣花酸和黃芩苷含量作為指標(biāo)，考察了藥材粒度、乙醇濃度、加醇量、提取時(shí)間的影響，優(yōu)選出榆芩顆粒的最佳醇提工藝.最佳工藝條件為: 藥材粉碎為粗粉，乙醇濃度60%，兩次提取，石榴皮單獨(dú)提取，第一次6倍量乙醇提取15 min、第二次4倍量乙醇提取10 min；剩余藥材第一次6倍量乙醇提取1 h，第二次4倍量乙醇0.5 h，合并所有濾液，然后減壓濃縮.驗(yàn)證試驗(yàn)表明,該提取工藝穩(wěn)定可行.