胃癌中miR-216a表達(dá)的變化及其對胃癌細(xì)胞侵襲的靶向調(diào)控作用

茍?zhí)m瓊，何平，鄭連喜，陳宗萬，屈敏，楊科，弓達(dá)秀

(1.攀鋼集團總醫(yī)院腫瘤科，四川 攀枝花 617023；2.唐山市人民醫(yī)院，河北 唐山 063001)

胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率高、治愈率低、整體預(yù)后較差[1-2]。腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響胃癌病情轉(zhuǎn)歸的重要因素，而癌細(xì)胞的侵襲是造成腫瘤轉(zhuǎn)移的重要病理環(huán)節(jié)，但目前胃癌細(xì)胞調(diào)控的機制并未完全闡明。微小RNA(miRs)是一類在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)的小分子非編碼RNA，通過改變靶基因的表達(dá)來產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。近年來，多種miRs被證實參與抑癌基因、原癌基因表達(dá)的調(diào)控并且與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。miR-216a是一種具有抑癌活性的miRs，在肺癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌等惡性腫瘤病灶內(nèi)均被證實呈低表達(dá)趨勢[3-5]。本實驗通過對胃癌中miR-216a表達(dá)的變化及其對胃癌細(xì)胞侵襲的靶向調(diào)控作用的研究，探尋其在胃癌發(fā)生發(fā)展中所起的作用及潛在作用機制。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 病例資料 胃癌組織和癌旁組織取自2015年3月至2018年10月唐山市人民醫(yī)院接受手術(shù)切除的38例胃癌患者。其中，男性23例，女性15例；年齡42～65歲，平均年齡(51.38±9.82)歲；患者術(shù)前均未接受過放化療且經(jīng)術(shù)后病理證實為胃癌?；颊吆炇鹬橥鈺?，并報院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 實驗材料 SGC7901細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞資源中心，miR-216a模擬物及對應(yīng)的陰性對照(NC)模擬物購自上海吉凱公司，miR-216a表達(dá)檢測試劑盒購自北京天根公司，Transwell小室購自Corning公司，Matrigel膠購自B&D公司，結(jié)晶紫購自上海碧云天公司，MMP2、MMP9、N-cadherin、p-JAK2、p-STAT3的第一抗體購自Abcam公司。超純RNA提取試劑盒、SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture(Low ROX)試劑盒購自北京康為世紀(jì)公司。

1.2 方法

1.2.1 miR-216a的檢測 取胃癌組織和癌旁組織，采用miRNA提取試劑盒提取組織中的miRNA后采用miRNAcDNA第一鏈合成試劑盒將miRNA合成為對應(yīng)的cDNA，采用miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒對cDNA中的miR-216a進行擴增，根據(jù)擴增曲線計算miR-216a的表達(dá)量。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 SGC7901用含有100 mL/L胎牛血清的DMEM在37 ℃、5%CO2、飽和濕度的環(huán)境中培養(yǎng)，細(xì)胞匯合至90%后常規(guī)用胰蛋白酶消化傳代，傳代后的細(xì)胞接種在培養(yǎng)板內(nèi)并進行轉(zhuǎn)染。NC組轉(zhuǎn)染NC的模擬物、miR-216a組轉(zhuǎn)染miR-216a的模擬物。

1.2.3 細(xì)胞侵襲的檢測 胰蛋白酶消化后的SGC7901細(xì)胞調(diào)節(jié)至2×105/mL，取0.2 mL接種在Transwell小室的上室內(nèi)，下室內(nèi)加入含有100 mL/L胎牛血清的DMEM 0.8 mL，轉(zhuǎn)染不同模擬物后24 h、48 h，用棉簽擦去半透膜上未發(fā)生穿膜的細(xì)胞，取下半透膜并用4%多聚甲醛固定30 min，而后用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，在顯微鏡下觀察并對穿膜細(xì)胞進行計數(shù)。

1.2.4 基因蛋白表達(dá)的檢測 SGC7901細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板內(nèi)，轉(zhuǎn)染不同模擬物后48 h，棄去培養(yǎng)基、保留細(xì)胞，加入蛋白裂解液后提取細(xì)胞內(nèi)的蛋白樣本，而后將蛋白樣本加入聚丙烯酰胺凝膠中，依次完成電泳、電轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶室溫封閉2 h、1:1 000第一抗體4 ℃孵育過夜、1:1 000第二抗體室溫孵育2 h，最后曝光得到蛋白條帶，根據(jù)條帶的灰度值計算蛋白表達(dá)量。

1.2.5 基因mRNA表達(dá)的檢測 SGC7901細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板內(nèi)，轉(zhuǎn)染不同模擬物后48 h，棄去培養(yǎng)基、保留細(xì)胞，采用超純RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中的RNA，采用SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后使用UltraSYBR Mixture(Low ROX)試劑盒配置PCR反應(yīng)體系，對cDNA中的MMP2、MMP9、N-cadherin、JAK2、STAT3進行擴增，根據(jù)擴增曲線計算mRNA表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-216a在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

熒光定量PCR檢測證實，胃癌組織和癌旁組織中miR-216a的表達(dá)量分別為(0.41±0.09)和(0.83±0.14)，胃癌組織中miR-216a的表達(dá)量明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.643、P=0.001)。見圖1。

2.2 不同病理特征胃癌組織中miR-216a表達(dá)的比較

TNM分期III期胃癌中miR-216a的表達(dá)量明顯低于TNM分期I-II期胃癌，低未分化胃癌中miR-216a的表達(dá)量明顯低于中高分化胃癌，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌中miR-216a的表達(dá)量明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.3 miR-216a對SGC7901細(xì)胞侵襲的影響

Transwell模型檢測SGC7901細(xì)胞穿膜數(shù)證實，轉(zhuǎn)染后24 h、48 h，miR-216a組SGC7901細(xì)胞的穿膜數(shù)明顯少于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2和表2。Western blot檢測證實，轉(zhuǎn)染后48 h，miR-216a組SGC7901細(xì)胞中MMP2、MMP9、N-cadherin的表達(dá)量均明顯低于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表3和表4。

病理特征例數(shù)miR-216at值P值TNM分期 I-II220.56±0.119.2120.001 III160.28±0.06分化程度 中高分化200.64±0.1312.8630.001 低未分化180.22±0.05淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 否230.60±0.1210.9730.001 是150.24±0.05

表2 兩組間SGC7901細(xì)胞穿膜數(shù)的比較

組別24 h48 hNC組(n=5)89.31±12.41125.48±20.19MiR-216a組(n=5)62.75±9.2988.58±12.58t值3.8313.469P值0.0050.008

組別MMP2MMP9N-cadherinNC組(n=5)1.08±0.180.98±0.130.91±0.15MiR-216a組(n=5)0.41±0.070.62±0.090.68±0.08t值7.7575.0913.025P值0.0010.0010.016

組別MMP2MMP9N-cadherinNC組(n=5)0.92±0.150.97±0.171.03±0.17MiR-216a組(n=5)0.55±0.070.61±0.080.67±0.09t值11.7524.2854.185P值0.0000.0030.003

2.4 miR-216a對SGC7901細(xì)胞中JAK2/STAT3通路的影響

Western blot檢測證實，轉(zhuǎn)染后48 h，miR-216a組SGC7901細(xì)胞中p-JAK2、p-STAT3的表達(dá)量均明顯低于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4、表5和表6。

組別p-JAK2p-STAT3NC組(n=5)0.89±0.130.97±0.15MiR-216a組(n=5)0.68±0.100.44±0.07t值 2.8637.160P值0.0210.001

組別JAK2STAT3NC組(n=5)0.91±0.181.03±0.21MiR-216a組(n=5)0.55±0.070.65±0.08t值 4.1683.781P值0.0030.005

3 討論

胃癌細(xì)胞侵襲所造成的病灶遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致晚期胃癌患者生存率較低的重要因素，探明胃癌細(xì)胞侵襲的調(diào)控機制有助于為靶向治療手段的研發(fā)提供依據(jù)。miRs在惡性腫瘤增殖、遷移、侵襲等惡性生物學(xué)行為的調(diào)控中起到重要作用，與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)結(jié)合后能夠抑制mRNA向蛋白質(zhì)的翻譯過程，進而在轉(zhuǎn)錄后水平實現(xiàn)對基因表達(dá)的調(diào)控并通過不同基因表達(dá)的變化來產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。在諸多與惡性腫瘤相關(guān)的miRs中，miR-216a是一類具有抑癌活性的miRs，在多種惡性腫瘤病灶內(nèi)均被證實呈低表達(dá)趨勢[3-5]。

近年來也有細(xì)胞實驗[6-8]證實，miR-216a能夠靶向調(diào)控乳腺癌、腎癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中miR-216a的表達(dá)量明顯低于癌旁組織，提示低表達(dá)的miR-216a與胃癌的發(fā)生有關(guān)。結(jié)合miR-216a對多種癌細(xì)胞侵襲的靶向調(diào)控作用推測，胃癌中低表達(dá)的miR-216a可能靶向促進癌細(xì)胞的侵襲、增加miR-216a的表達(dá)則能抑制癌細(xì)胞的侵襲。

為了進一步驗證上述關(guān)于miR-216a在胃癌細(xì)胞中生物學(xué)效應(yīng)的推測，miR-216a的模擬物被轉(zhuǎn)染進入胃癌細(xì)胞株SGC7901中，通過miR-216a的模擬物來增強miR-216a的生物學(xué)功能后檢測了細(xì)胞的侵襲情況。MMP2、MMP9是MMPs家族的重要成員，在胃癌中的高表達(dá)能夠促進細(xì)胞外基質(zhì)的水解并使細(xì)胞不斷向鄰近組織侵襲[9-10]；N-cadherin是間質(zhì)表型標(biāo)志物，在胃癌中的高表達(dá)能夠使細(xì)胞間黏附性和極性減弱，進而有利于癌細(xì)胞向鄰近組織運動[11]。本研究結(jié)果顯示，miR-216a組的穿膜細(xì)胞數(shù)少于NC組，細(xì)胞中侵襲基因MMP2、MMP9、N-cadherin的蛋白表達(dá)及mRNA低于NC組，表明miR-216a對胃癌細(xì)胞的侵襲具有抑制作用。

胰腺癌中關(guān)于MiR-216a調(diào)控癌細(xì)胞侵襲的實驗[12]證實，細(xì)胞中直接受到miR-216a靶向調(diào)控的基因是JAK2/STAT3信號通路，該信號通路是具有促增殖、促侵襲作用的通路，信號分子以磷酸化的形式發(fā)生激活后能夠在細(xì)胞核內(nèi)啟動MMP2、MMP9、N-cadherin等侵襲基因的表達(dá)，進而通過侵襲基因的生物學(xué)效應(yīng)來促進細(xì)胞侵襲[13-14]。本研究結(jié)果顯示，miR-216a組細(xì)胞中p-JAK2、p-STAT3的蛋白表達(dá)量及JAK2、STAT3的mRNA表達(dá)量均明顯低于NC組，提示胃癌細(xì)胞中JAK2/STAT3信號通路直接受到miR-216a的靶向調(diào)控，miR-216a通過抑制JAK2/STAT3信號通路來抑制胃癌細(xì)胞的侵襲及細(xì)胞中多種侵襲基因的表達(dá)。見圖5。

綜上所述，胃癌中miR-216a的低表達(dá)能夠靶向促進胃癌細(xì)胞的侵襲且該作用與JAK2/STAT3信號通路有關(guān)，miR-216靶向調(diào)控JAK2/STAT3信號通路的機理如圖5所示。本研究能夠為深入探究胃癌侵襲的調(diào)控機制及相應(yīng)的靶向治療藥物提供參考依據(jù)。