雙氫青蒿素對肺纖維化大鼠ERK和CTGF表達(dá)的影響

王保蘭，王立新，朱蓉

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院呼吸科，江蘇 淮安 223000)

肺纖維化是一種彌漫性肺炎性疾病，病死率高。結(jié)締組織生長因子為促纖維化生長因子參與多種增生性或纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展，但具體致病機(jī)制尚不明確[1]。肺纖維化傳統(tǒng)治療以使用激素和免疫抑制劑為主，但效果并不理想。研究[2-4]證實(shí)，阻斷ERK信號(hào)通路可以抑制CTGF表達(dá)，從而干預(yù)組織纖維化。雙氫青蒿素是青蒿素的一種提取物，其對炎癥和炎癥相關(guān)性疾病具有治療作用[5]；另有實(shí)驗(yàn)研究[6]證實(shí)，雙氫青蒿素還可抑制纖維化大鼠肺組織炎癥因子聚集、成纖維細(xì)胞增生及膠原蛋白沉積，提示其可能為肺纖維化的藥物治療提供新思路。袁曉梅等[7]研究發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素可干預(yù)博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型，然其具體作用機(jī)制尚不明確。作者此前研究也發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素可通過抑制TGFβ1和SMAD2/3的表達(dá)干預(yù)肺纖維化[8]。本實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步研究雙氫青蒿素對博萊霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維中ERK和CTGF表達(dá)的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與主要試劑 藥物注射用鹽酸博萊霉素購自日本化藥株式會(huì)社(批號(hào)：140372)，雙氫青蒿素購自成都?xì)W康植化有限公司(批號(hào)：AB140901)，醋酸潑尼松片購自廣東華南藥業(yè)有限公司。TRNZOL總RNA提取試劑購自北京天根生物技術(shù)有限公司(編號(hào)：DP405-02)，TIANScriPt cDNA第一鏈合成試劑盒購自北京天根生物技術(shù)有限公司(編號(hào)：KR104-02)，SYBR Premix Ex Taq購自Takara生物有限公司(編號(hào)：RR420A)；col1(a2)引物(108bp)，上游：5′-GAGGGCAACAGCAGATTCAC-3′，下游：5′-GCGAGATGGCTTATTCGTTT-3′；ERK1引物(110bp)，上游：5′-CCCTTGACCTGAGTGATGAG-3′，下游：5′-CATAGCCCTTCCATTCCAGA′3′；ERK2引物(136bp)，上游：5′-CACATCCTGGGTATTCTTGGA-3′，下游：5′-AGTCAGCGTTTGGGAACAAC，

內(nèi)參β-actin(132bp)，上游5′-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3′，下游5′-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3′，各引物由上海生工公司合成。濃縮型DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司(編號(hào)：ZLI-9017)，超敏二步法免疫組化檢測試劑購自北京中杉金橋生物有限公司(編號(hào)：PV-9001)，兔抗鼠pERK1/2單克隆抗體購自CST公司，兔抗鼠ERK1/2單克隆抗體購自CST公司，兔抗鼠CTGF多克隆抗體購自博士德生物公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SPF級SD大鼠，雄性，體重為180～220 g，由徐州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。75只隨機(jī)分成假手術(shù)對照組、模型對照組、溶劑對照組、陽性對照組、和雙氫青蒿素治療組5組，每組15只；每組再按處死時(shí)間點(diǎn)分為7 d、14 d、28 d三個(gè)亞組，每個(gè)亞組5只。除假手術(shù)對照組外，所有動(dòng)物氣管內(nèi)注入博來霉素5 mg/kg。造模后第一天起，相應(yīng)予生理鹽水、生理鹽水、5%羧甲基纖維素鈉、潑尼松5 mg/kg、雙氫青蒿素75 mg/kg，1次/d，持續(xù)至處死當(dāng)天。于末次給藥8 h后處死動(dòng)物，取血分離血清或血漿冷藏備用，取左肺用4%多聚甲醛固定，留取右肺冷藏備用。

1.2 方法

1.2.1 模型驗(yàn)證 用HE染色法觀察肺組織病理形態(tài)變化，驗(yàn)證肺纖維化模型是否成功。

1.2.2 熒光定量PCR法檢測ERK1、ERK2、Col-1基因的表達(dá)量 (1)提取RNA：取30 mg肺組織放入液氮研缽磨成粉末，將粉末移入1.5 mL EP管，加入1 mL TRIZOL，充分搖勻，室溫靜置5 min，加入200 μL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫靜置5 min；4 ℃，12 000 rpm離心15 min；取上層水相400 μL轉(zhuǎn)移至另一1.5 mL EP管中，加入等體積異丙醇，輕輕混勻。室溫靜置10 min；4 ℃，12 000 rpm離心10 min；棄上清，加入預(yù)冷的75%乙醇1 mL(無核酶雙蒸水配置)，洗滌沉淀，輕輕混勻；4 ℃，7 500 rpm離心5 min；重復(fù)洗滌沉淀；棄上清液，室溫干燥5 min，50 μL無核酶雙蒸水充分溶解；取2 μLRNA原液加入98 μL無核酶雙蒸水中，充分混勻，測定RNA濃度；(2)逆轉(zhuǎn)錄：在冰浴無核酶離心管中加入2 μL RNA原液(5 μgRNA)、2 μL Oligo(dT)、2 μL Super Pure dvip，補(bǔ)無核酶雙蒸水定容至14.5 μL；70 ℃加熱5 min后迅速在冰上冷卻2 min，簡短離心后加入4 μL 5xFirst-strumd buffer(含DTT)、0.5 μL Rvasin、1 μL IIAScript m-MLV，輕輕用移液器混勻；42 ℃溫浴50 min；95 ℃加熱5 min終止反應(yīng)，冷凍保存于-20 ℃冰箱。(3)熒光定量PCR：按照Takara SYBR Premix試劑盒說明書配制擴(kuò)增反應(yīng)體系，上機(jī)，94 ℃ 3 min，(94 ℃30 s 56 ℃30 s 72 ℃30 s 72 ℃ 10 min)共36cycle，測定CP值，用雙delta法計(jì)算，結(jié)果用2^(-△△Ct)表示。

1.2.3 免疫組化法檢測CTGF、ERK1/2、pERK1/2蛋白的表達(dá)量 石蠟切片常規(guī)脫蠟、沖洗，用檸檬酸緩沖液行高壓抗原修復(fù)，3% H2O2去離子水(終50 μL)37 ℃孵育15 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性；滴加試劑A室溫孵育10 min，頃去，滴加CTGF(1∶100)、ERK1/2(1∶400)、pERK1/2(1∶400)稀釋一抗，4 ℃冰箱過夜，滴加試劑B37 ℃孵育10 min，滴加試劑C 37 ℃孵育10 min，顯微鏡下控制DAB顯色時(shí)間，自來水沖洗，終止顯色，蘇木素復(fù)染5 min，水洗1 min，鹽酸分化3 s，水洗1 min，碳酸鋰返藍(lán)1 min，水洗1 min；梯度酒精脫水，二甲苯透明后，中性樹脂封片，光鏡下拍攝下免疫組化染色圖片，每張切片隨機(jī)選擇五個(gè)視野各采集一張，用Image-Pro Plus6.0進(jìn)行圖像分析，選定染色陽性區(qū)域，記錄IOD和Area，計(jì)算IOD/Area，并取五張的平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 病理形態(tài)改變

顯微鏡下觀察假手術(shù)對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，各時(shí)間點(diǎn)肺泡結(jié)構(gòu)正常，無明顯病理改變；模型對照組大鼠7 d時(shí)肺組織呈急性炎癥反應(yīng)，肺泡間質(zhì)有大量炎癥細(xì)胞浸潤，伴有水腫出血，14 d時(shí)肺泡壁增厚，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，成纖維細(xì)胞增生，可見較多膠原沉積，28 d時(shí)肺泡結(jié)構(gòu)大量破壞，肺泡壁顯著增厚，肺纖維化瘢痕形成，膠原纖維大量沉積；與模型對照組相比，陽性對照組前期肺泡炎癥輕，后期肺泡間隔增寬、肺泡結(jié)構(gòu)破壞及膠原沉積程度輕；與陽性對照組比較，雙氫青蒿素治療組前期肺泡炎癥程度與之相似，后期肺泡結(jié)構(gòu)完整性較好，膠原沉積量少。見圖1。

2.2 熒光定量PCR法檢測各組肺組織中Col1(a2)、ERK1、ERK2基因相對表達(dá)量

模型對照組大鼠肺組織Col1(a2)、ERK1、ERK2基因相對表達(dá)量均比假手術(shù)對照組高(P<0.01)，模型對照組與溶劑對照組組間各基因相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型對照組比較，雙氫青蒿素治療組Col1(a2)、ERK1、ERK2基因相對表達(dá)量均低(P<0.01)；與陽性對照組比較，7 d、14 d雙氫青蒿素治療組大鼠肺組織Col1(a2)、ERK1、ERK2基因相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，28 d雙氫青蒿素治療組大鼠肺組織 Col1(a2)、ERK1、ERK2基因相對表達(dá)量低(P<0.01)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.3 免疫組化法測大鼠肺組織CTGF、ERK1/2、pERK1/2表達(dá)量

與假手術(shù)對照組比較，模型對照組CTGF、ERK1/2、pERK1/2蛋白表達(dá)量高(P<0.01)，模型對照組與溶劑對照組組間CTGF、ERK1/2、pERK1/2蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型對照組比較，雙氫青蒿素治療組CTGF、ERK1/2、pERK1/2蛋白表達(dá)量少(P<0.01)； 7 d、14 d雙氫青蒿素治療組CTGF、ERK1/2、pERK1/2蛋白表達(dá)量與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；28 d時(shí)雙氫青蒿素治療組CTGF、ERK1/2、pERK1/2蛋白表達(dá)少于陽性對照組(P<0.05)。見圖2-圖4及表2。

表1各組不同時(shí)間點(diǎn)肺組織Col1(a2)、ERK1、ERK2基因相對表達(dá)量測定結(jié)果(2^(-△△Ct)值，n=5)

組別Col1(a2)ERK1ERK2假手術(shù)對照組 7 d0.96±0.0530.97±0.0330.96±0.141 14 d1.01±0.0551.01±0.0450.99±0.238 28 d1.09±0.0641.08±0.0391.03±0.056模型對照組 7 d2.41±0.128*2.27±0.201*1.79±0.791* 14 d4.60±0.131*3.52±0.391*2.57±0.606* 28 d4.60±0.131*5.33±1.003*6.70±1.003*溶劑對照組 7 d2.23±0.0922.15±0.2871.65±0.584 14 d4.29±0.2793.40±0.9092.44±0.811 28 d8.37±0.9344.69±0.9127.09±1.214陽性對照組 7 d1.30±0.0411.02±0.0511.34±0.062 14 d2.94±0.1232.32±0.0831.63±0.413 28 d3.87±0.2223.69±0.1744.01±0.513雙氫青蒿素治療組 7 d1.34±0.032#1.10±0.037#1.28±0.038# 14 d2.47±0.081#1.45±0.061#1.53±0.307# 28 d3.18±0.131#△2.07±0.091#△2.67±0.285#△

*P<0.01，與假手術(shù)組和雙氫青蒿素治療組相比；#P<0.01與模型對照組相比；△P<0.01，與陽性對照組相比。

表2各組不同時(shí)間點(diǎn)肺組織CTGF、ERK1/2、pERK1/2蛋白表達(dá)測定結(jié)果(IOD/Area，n=5)

組別CTGFERK1/2PERK1/2假手術(shù)對照組 7 d0.11±0.0710.08±0.0830.06±0.067 14 d0.12±0.1030.10±0.0780.09±0.071 28 d0.09±0.0800.11±0.0520.10±0.043模型對照組 7 d0.27±0.132*0.23±0.105*0.21±0.121* 14 d0.31±0.201*0.29±0.153*0.28±0.146* 28 d0.23±0.164*0.31±0.141*0.30±0.134*溶劑對照組 7 d0.26±0.1840.24±0.1100.21±0.109 14 d0.32±0.2320.27±0.1710.24±0.143 28 d0.22±0.1750.30±0.1520.29±0.118陽性對照組 7 d0.18±0.1100.16±0.0860.14±0.105 14 d0.21±0.0930.17±0.0990.15±0.094 28 d0.16±0.0740.22±0.1010.18±0.075雙氫青蒿素治療組 7 d0.17±0.097#0.14±0.079#0.13±0.082# 14 d0.19±0.102#0.15±0.085#0.15±0.077# 28 d0.13±0.081#△0.16±0.063#△0.13±0.083#△

*P<0.01，與假手術(shù)組和雙氫青蒿素治療組相比；#P<0.01與模型對照組相比；△P<0.05，與陽性對照組相比。

3 討論

肺纖維化是進(jìn)展性、致死率極高的疾病，隨著對肺纖維化發(fā)病機(jī)制的深入研究，國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)集中于尋找新的抗纖維化藥物，并盡可能在疾病的早期進(jìn)行干預(yù)治療[9]。研究[10]發(fā)現(xiàn)，肺纖維化是多種細(xì)胞因子、生長因子調(diào)節(jié)失衡的結(jié)果，成纖維細(xì)胞增殖分化，細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積為其特征性表現(xiàn)。雙氫青蒿素類藥物除了抗瘧作用外，還具有抗炎、抗纖維化的[11]藥理作用。

ERK蛋白是MAPK家族的一員，所介導(dǎo)的信號(hào)傳遞途徑是涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、發(fā)育及分裂的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的核心，在多種細(xì)胞異常增殖類疾病(如腫瘤，纖維化疾病等)中起到了重要的作用[12-13]。研究[14-15]證實(shí)，ERK信號(hào)通路與肺纖維化發(fā)生關(guān)系密切，可介導(dǎo)靶細(xì)胞的分化、增殖、合成、分泌細(xì)胞外基質(zhì)以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及其炎性反應(yīng)等多種細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。ERK通路是調(diào)節(jié)CTGF表達(dá)的重要信號(hào)通路，實(shí)驗(yàn)證實(shí)阻斷ERK通路可抑制血管緊張素II誘導(dǎo)細(xì)胞的CTGF表達(dá)[16]。另有研究[17-19]證實(shí)，肺成纖維細(xì)胞過表達(dá)CTGF與肺纖維化關(guān)系密切,抑制CTGF的表達(dá)對肺纖維化進(jìn)展有干預(yù)作用。本研究對雙氫青蒿素對肺纖維化模型大鼠肺組織中CTGF、ERK1/2基因和蛋白表達(dá)的影響進(jìn)行探討。

由本研究病理學(xué)結(jié)果可知，模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整性破壞嚴(yán)重，肺泡間隔厚，肺組織中有大量疤痕組織形成，假手術(shù)對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)未見明顯異常，證實(shí)博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型構(gòu)建成功。與模型對照組比較，雙青蒿素治療組大鼠肺組織可見少許纖維疤痕組織，然肺泡結(jié)構(gòu)的完整性較好，肺泡間隔較薄，說明雙氫青蒿素可改善模型大鼠的肺纖維化破壞程度。從熒光定量PCR結(jié)果可知雙氫青蒿素治療組大鼠肺組織Col1(a2)基因表達(dá)量少于模型對照組大鼠。細(xì)胞間質(zhì)膠原纖維大量沉積是肺纖維化的顯著特征，Col1(a2)為膠原纖維的主要組成成分之一，雙氫青蒿素抑制Col1(a2)基因的表達(dá)，可減輕肺纖維化程度，袁曉梅等人關(guān)于雙氫青蒿素干預(yù)肺纖維化的研究結(jié)果支持作者研究結(jié)果。從熒光定量PCR及免疫組化結(jié)果可知雙氫青蒿素治療組大鼠肺組織ERK1、ERK2的基因表達(dá)及CTGF、ERK1/2、pERK1/2蛋白表達(dá)量均少于模型對照組大鼠，說明雙氫青蒿素對CTGF、ERK基因及蛋白的表達(dá)具有一定的抑制作用。CTGF可介導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞增生、遷移和分化，CTGF是肺組織損傷和纖維化的必須生長因子[15]。ERK信號(hào)通路是除SAMD2/3信號(hào)通路外調(diào)節(jié)CTGF表達(dá)的重要信號(hào)通路，作者將CTGF基因及蛋白表達(dá)與ERK基因及蛋白表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行比較，得出兩者各時(shí)間點(diǎn)均呈正相關(guān)。有研究[20]證實(shí)，ERK1/2磷酸化可干預(yù)人成纖維細(xì)胞CTGF的表達(dá)，這也支持本研究結(jié)論。

綜上，ERK和CTGF的表達(dá)與肺纖維化關(guān)系密切，雙氫青蒿素對博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型中ERK和CTGF基因和蛋白的表達(dá)有干預(yù)作用，這為肺纖維化的新藥研究及肺纖維化的靶向治療提供新思路。